凝集素是一類具有凝集細胞或沉降復(fù)合糖質(zhì)作用的非免疫起源的蛋自質(zhì) 或糖蛋白，廣泛存在于動植物和微生物中。凝集素的發(fā)現(xiàn)距今己有〗00多年 的歷史了，其最初的研究目的主要是為了闡明藥用植物物質(zhì)的毒性機理，以 及用于刺激產(chǎn)生抗體的免疫學(xué)研究。自二十世紀六十年代，凝集素研究發(fā)展 到了一個新的階段，人們開始從分子水平更廣泛、更深入的研究這類物質(zhì)。 如今，凝集素作為抗腫瘤藥物的研究己經(jīng)發(fā)展到了一定階段。它的作用是通 過免疫調(diào)節(jié)作用提高機體免疫力從而殺傷腫瘤細胞，對宿主細胞的毒副作用 很低，與傳統(tǒng)的放化療及化學(xué)合成藥物相比，具有明顯的優(yōu)勢。

微生物凝集素(microbial lectins，ML)最先發(fā)現(xiàn)的時間是1908年，Gugot 從大腸桿菌(Escherichiacoli)中找到了能凝集血細胞的凝集素。至今，已發(fā)現(xiàn) 了 208種以上的ML物質(zhì)分析得知，常見的ML在微生物體的部位為細 胞表面。它們可以與細胞聯(lián)系不密切，如特定的表面細胞器上，包括細菌菌 毛(fimbria)或纖毛(pm)。這些物質(zhì)有時被稱作為粘附素(adhesins)，它們中許 多具凝血能力。

如同多數(shù)其他生物來源的凝集素一樣，大多數(shù)ML的一個重要特性是對 某些/某種糖有結(jié)合性能，它具有可變換性和非共價性，其中有的結(jié)合能力的 特異/專一性很強D迄今發(fā)現(xiàn)與ML結(jié)合的糖及其衍生物之范圍雖然有限，但 也達60種以上^分析認為，這些糖大多屬于單糖、寡糖或者雙糖之類，而以 甘露糖為多見，其次是半乳糖等。與同病原菌發(fā)生反應(yīng)的動植物凝集素的結(jié) 合的糖種類相比，有一定差別⑵。

ML之所以如此引人注自，一是因為研究微生物本身所需。凝集素是微生 物自身進化發(fā)展之需。—些微生物，包括各類病原菌，需要與寄主發(fā)生各種

關(guān)系以發(fā)展自己。它們的凝集素可以是感染動物的毒力決定子，其中以大腸 桿菌對甘露糖和gaigal-專一的菌毛凝集素為突出例子。二是因為一些ML 有助于其產(chǎn)生菌選擇識別寄主的表皮細胞，或者識別高等動物的白細胞《在 此，該凝集素起著細胞與細胞間相互作用中的識別分子(recognition molecules) 作用[3]。凝集素在此起識別活動的決定子(determinat)作用，如粘球菌 (Myxococcus)的細菌所顯示的那樣。這說明ML在介導(dǎo)各種正常和病理過程 中都起重要作用[4]。 試驗材料：

1)血紅細胞的制備

人的B型血樣和小鼠由大連醫(yī)科大學(xué)提供，動物血樣取自大連市長興農(nóng) 貿(mào)市場。均取全血，用3.8 % (M/M)枸櫞酸鈉溶液抗凝，各抗凝血經(jīng)2000 r/min 離心10 min除去血漿，加10倍體積的TBS溶液充分洗洚，然后經(jīng)K!00r/min 離心3 min去上清液，重復(fù)4次，最后經(jīng)2500 r/min離心3min，一部分配成 2% (V/V)的TBS-Ca2+紅細胞懸浮液；另一部分配成不含Ca2+的2 % (V/V) 的TBS紅細胞懸浮液。

將紅細胞懸浮于lOmlTBS中，加入2mg胰蛋白酶,371：下消化1.5小時。 然后用TBS洗3次，在TBS中配成2%紅細胞懸浮液。

2)菌懸液的制備

將菌種接種于黃原膠固體培養(yǎng)基上，于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2天， 待新生菌體長出后，用 TBS-Ca2+溶液（TBS: 0.14 mol/L NaCl, 0.01 mol/L Tris-HCl，pH=7.4; TBS-Ca2+: TBS 中含 0.01 mol/L CaCl2, pH=7.4)洗下菌 落制成菌懸液。

黃原膠固體培養(yǎng)基組成：瓊脂粉2%,蛋白胨0.1%,酵母浸出粉0.1%, 黃原膠0.3%，葡萄糖0.2 %,水97.3%。

S.1血凝活性的測定 試驗方法：

活力測定在96孔U型微量血凝板中進行。先在每孔中加入25nLTBS-Ca2+ 溶液，再往第1孔中加入25隊樣品，混勻后，再從第1孔中吸取2SnL上述混合 液加入第2孔，以此類推作倍比稀釋，最后在每孔中加入25nL2 % (V/V)的 TBS-Ca2+溶液紅細胞懸浮液，振蕩搖勻，在室溫放置1?2小時后，肉眼觀察。 如紅細胞不發(fā)生凝集則在“U”型血凝板小孔內(nèi)沉于孔底形成一界線清晰的紅 色小點；如發(fā)生凝集，紅細胞之間則形成一似網(wǎng)絡(luò)擴散的紅斑塊。以有紅細 胞凝集活力的最大稀釋度為該凝集素樣品的凝集活力(凝集效價)，記為2n，以 TBS-Ca2+作空白對照。

結(jié)果與討論；

XT-1I菌懸液對人的B型血及家兔、家雞、家鴿、小鼠等4種動物紅細 胞的凝集效價見表鞘氨醉單胞菌XT-11菌懸液對家兔的紅細胞凝集作 用最強，凝集效價為26;對家雞的凝集作用次之，為24;它不凝集小鼠和家 鴿的紅細胞，同時也不凝集人的B型紅細胞以及胰蛋白酶處理的人的B型紅

細胞。

表5-]鞘氨醉單胞菌的凝集活性

Table 5-1 Hemagglutinationg activity of Sphingmonas sp.

紅細胞類型凝集效價紅細胞類型凝集效價

人B型0家鴿0

胰蛋白酶處

理后的人B型0家雞24

 

5.2糖抑制試驗

試驗方法：

選取16種單糖、寡糖和糖蛋白，分別制成濃度為200 mmol/L的溶液。 往每一孔中加入25^iL糖溶液，然后加入25^1菌懸液，最后往各孔中加入 25pL的2%(V/V)的兔紅細胞-TBS-Ca2+懸浮液，在室溫下靜置2小時后，檢 査凝集情況。

結(jié)果與討論：

表5-2為16種糖對鞘氨醇單胞菌懸液凝集兔紅細胞的影響。結(jié)果顯示： 只有肝素可抑制菌懸液對兔血紅細胞的凝集作用。至于其他糖類是否可以抑 制其對兔血紅細胞的凝集作用，還有待于進一步的證明。

表5-2糖和糖蛋白對鞘氨酵單胞菌懸液血紅細胞凝集活性的抑制作用 Table 5-2 Inhition of hemagglutination activity XT-11

抑制劑能否抑制抑制劑能否抑制

半乳糖-Heparin+

甘賻糖-D(-)Ribose-

N-乙酰半乳糖敢胺-Mucin-

N-乙酰葡萄糖酰胺琴Asialo-mucin-

巖藻糖-硫酸軟骨素-

葡萄糖-P -Nitrophenyl-a-D-galactopyranose-

Metalose-D(+)Glucosamir hydrochloride-

Lactose-Thyroglobulin-

53熱穩(wěn)定性 試驗方法：

將菌懸液樣品分別在4°C冰箱及溫度為20BC, 30DC, 37°C，4(TC，5CTC，

60 °C的恒溫水浴中處理30min，測定各樣品的凝集活力。

結(jié)果與討論：

菌懸液XT-11血凝集的熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果見圖5-〗。菌懸液血凝集活性具 有一定的熱穩(wěn)定性。在4‘C時效價最髙為26,隨著溫度的降低凝血活性逐漸下 降，當溫度到達6CTC時喪失活性。這表明它的血凝集活性是熱不穩(wěn)定的。

pH

圖5，1菌懸液血凝活性溫度依賴性

圖5-2菌懸液血凝活性pH依賴性

Figure 5-1

Figure 5-2 Influence of pH on the agglutinative activity

5.4 PH影響的測定

試驗方法：

在測定pH對菌懸液凝集活性影響時，使用下列緩沖液：pH為4~6的 Hac-NaAc緩沖液；pH為7?9的Tris-HCl緩沖液;pH為10-11的Gly-NaOH緩沖 液。將血清樣品的pH值調(diào)至40, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9,0和10.0,在4°C密封 的容器中放置2小時，然后將各溶液的pH值調(diào)至7.4,測定各樣品的凝集活力。 結(jié)果與討論：

XT-11菌懸液在不同pH值條件下的凝集反應(yīng)實驗表明，菌懸液中的凝集素 對pH值的變化比較敏感（圖5-2).由于在pH值低于5或高于10時兔紅細胞發(fā)生

全部或部分溶血現(xiàn)象，影響實驗的結(jié)果，因此沒有統(tǒng)計在結(jié)果中，但從圖2 也可以看出鞘氨醇單胞菌的凝集活性具有一定的pH值穩(wěn)定性。在pH為6.0? 10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。

S.5Ca2+對血凝活力的影晌

試驗方法：

取菌懸液25pL,在96孔U型板中與等量的TBS溶液經(jīng)系列倍比稀釋后， 每孔分別加入25juL的10, 20, 40 mmoi/L的EDTA溶液，用2% (V/V)的兔 紅細胞-TBS懸浮液檢測其活性；若活性降低或消失，則加入0.05mol/L TBS-Ca2+溶液，觀察其活性的變化。對照組用TBS-Ca2+溶液作倍比稀釋，用 2°/〇 (V/V)的兔紅細胞-TBS-Ca2+懸浮液檢測其活性。

結(jié)果與討論：

金屬離子螯合劑EDTA對XT-11菌懸液的凝集活力沒有抑制作用。將XT-11 菌懸液在40 mmol/LEDTA溶液中透析過夜后，在不含Ca2+的TBS緩沖液中透 析，然后測定其血凝活性。同時在分別加入10, 20, 30, 40 rmnol/LCa2+的 TBS緩沖液中測定其血凝活性。發(fā)現(xiàn)它的血凝活性沒有任何變化。這表明 XT-11菌懸液的血凝活性不受EDTA的影響，不依賴于Ca2'

S.6鞘氨醇單胞菌XT_11的粗提蛋白對血凝活性的影響 試驗方法：

將鞘氨醇單胞菌XT-11在KS-250型超聲波細胞粉碎機（寧波科生儀器廠， 中國）上粉碎20 min，用含0.15 mol/LNaCl的TBS溶液在4°C抽提過夜。 5〇OOr/miii離心2〇1^11取上清液。加入硫酸銨到7〇%濃度(>5〇〇〇^0士1離心2〇1^11， 收集沉淀，溶于含0.15mol/LNaCl的TBS溶液中，在此緩沖液中透析除去硫 酸銨《測定其血凝活性。

結(jié)果與討論:

鞘氨醉單胞菌XT-U的蛋白樣物質(zhì)經(jīng)硫酸銨鹽析、TBS溶解蛋白沉淀、透

析脫鹽后，獲得的粗提蛋白溶液，發(fā)現(xiàn)其仍然具有血凝活性。

5.7本章小結(jié)

鞘氨醇單胞菌XT-1I懸液能凝集2種血紅細胞。菌懸液對兔紅細胞的凝集可以被肝素所抑制。其凝集活性不依賴于Ca2+;在pH為6.0?10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定；它的凝集活性在6CTC時完全喪失。以上結(jié)果表明：該菌含有具有紅細胞

凝集活性的物質(zhì)。