早秈稻在我國(guó)南方由于高溫早秈稻米的直鏈淀粉品質(zhì)含量普遍偏低或過(guò)高[1w3。針對(duì)這一問(wèn) 題，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者從早秈稻的直鏈淀粉含量的遺傳規(guī)律、品種特性及環(huán)境影響效應(yīng)角度已做了不少工作[4"6]，但是對(duì)早秈水稻灌漿結(jié)實(shí)過(guò)程中胚乳物質(zhì)及酶類(lèi)變化很少涉 及[1，7]，對(duì)不同品質(zhì)類(lèi)型早秈品種籽粒灌漿過(guò)程中有關(guān)淀粉合成代謝關(guān)鍵酶活性變化及其溫 度效應(yīng)特征的差異，目前尚不清楚。為此，本文以水稻籽粒灌漿過(guò)程中不同類(lèi)型淀粉的累積 變化特征及有關(guān)淀粉合成代謝的關(guān)鍵酶活性分析為基礎(chǔ)，并通過(guò)人工氣候箱控溫試驗(yàn)，對(duì)不 同品質(zhì)類(lèi)型早秈品種籽粒灌漿過(guò)程中ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶與淀粉分支酶活 性變化及其在不同溫度處理下差異特征進(jìn)行了探討，旨在揭示不同品質(zhì)類(lèi)型早秈間的蒸煮食 味品質(zhì)差異及溫度影響的內(nèi)在生理基礎(chǔ)，為米質(zhì)的生態(tài)、品種改良工作提供理論依據(jù)。

 

1材料與方法1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)于1999年在浙江大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，選用高直鏈淀粉早秈品種73 - 07(直鏈淀 粉含量25.18%)、低直鏈淀粉含量早秈品種嘉早93，（直鏈淀粉含量13.21%)，3月25日播 種，4月20日移栽，株、行距15 cmx20 cm，田間常規(guī)栽培管理，在各品種在生長(zhǎng)至齊穗時(shí)選 取生長(zhǎng)一致的單穗300 "400個(gè)，掛牌并標(biāo)記開(kāi)花日期基本接近的中、上位勢(shì)小花，以后每隔 5天取樣，液氮中保存，最后統(tǒng)一測(cè)定。人工氣候箱控溫試驗(yàn)使用2臺(tái)CONVIRON箱，設(shè)高溫 33<(最高溫38</最低溫28°C)和適溫23<(最高溫28</最低18°C)2個(gè)溫度處理，采用盆 栽土培，在自然溫度條件下生長(zhǎng)至抽穗后再將稻株移入不同溫度處理的人工氣候箱中，人工 氣候箱內(nèi)溫度的日變化模擬自然氣候特征，24h程序自控，相對(duì)濕度保持90%左右，光強(qiáng)為 0.5 "2.5萬(wàn)1@，取樣方法同大田處理。

 

1.2測(cè)定方法1.2.1粗酶液的提取 取樣品籽粒25粒，去殼稱(chēng)重，碾磨成粉，加5 mL提取液（含100 mmol^L Tricine-NaOH， pH = 7.5， 8 mmo^^L MgC12， 2 mmo^^L EDTA， 12.5%i( p/v，Glycerol; 1% (w/v)PVP-40，50mmo1/L2-Mercap-toethano1)，磨成勾楽，在30000xg尚心10min，然后收集上清液置于冰浴，作為粗酶液備用。

 

1.2.2 ADPG焦磷酸化酶活性的測(cè)定取20 yL酶粗提液加入110 !^反應(yīng)液中（反應(yīng)液最終濃度是100mmo1/LHepes-NaOH(pH = 7.4)、1.2mmo1/LADPG，3mmo1/LPPi;5mmo1/LMg- C12,4mmo1/LDTT)，30°C反應(yīng)20min后，沸水中終止反應(yīng)30s，10000xg，10min;取上清液 100 yL 加 5.2 yL 比色液(5.76 mmol/L NADP，0.08 unit P-gucomutase，0.07 unit G6P-dehydroge- 打186, . 30< 反應(yīng) 10 min 后，測(cè)定 340 nmOD 值。

 

1.2.3可溶性淀粉合成酶活性的測(cè)定取20 yL酶粗提取液加入36 yL反應(yīng)液（反應(yīng)液最終濃度為50 mmol/L Hep es-NaOH(pH = 了，、1.6 mmol/L ADPG、0.7 mg amylopectin、15 mmol/L D訂，30<反應(yīng)20min后，沸水中終止反應(yīng)30s，冰浴中冷卻；加20ML反應(yīng)液(含50mmol/L Hepes-NaOH(pH = 7.4,、4 mmol/L PEP、200 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2、1.2 unit Pyruvate Ki?nase， 30<反應(yīng) 20 min 后，沸水中終止反應(yīng)， 10000 x g 尚心 10 min。

 

取上清液 60 yL 與 43 yL 反應(yīng)液(50 mmol/L Hepes-NaOH(pH = 7.4)、10 mmol/L Glucose 20 mM MgCl2、2 mmol/L NADP、1.4 unit Hexokinase、0.35 unit G6P-dehydrogenase)，30<反應(yīng) 10 min 后，測(cè)定340 nmOD值的變化。

 

1.2.4淀粉分支酶活性的測(cè)定取20 yL粗酶液加20 yL反應(yīng)液（反應(yīng)液最終濃度為50mmol/L 1萬(wàn)方數(shù)NHH(pH = 7.4，5 mmol/L GlP，1.25 mmol/L AMP，phosphorylase (5.4 unit，30#反應(yīng) 30 min 后，101 mol/L HC1 終止反應(yīng)，然后加 100 Dimethylsulfoxide 和 1400.

 

1% 的 12 和 1%KI，測(cè)定 540 nmOD 值。

 

1.2.5稻米直、支鏈淀粉含量的測(cè)定參照何照范的雙波長(zhǎng)法[8]，并做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)其中直鏈淀粉含量測(cè)定的主波長(zhǎng)用620 nm，參比波長(zhǎng)用430 nm，支鏈淀粉含量測(cè)定的主波長(zhǎng)用540 nm，參比波長(zhǎng)用720 nm。以脫脂精米米粉為樣品進(jìn)行測(cè)定。其中對(duì)水稻開(kāi)花后5天的采樣， 用手工方法去殼除糙。

 

2結(jié)果與分析2.1不同早秈品種籽粒灌漿過(guò)程中直、支鏈淀粉含量的積累趨勢(shì)由圖1、圖2可見(jiàn)，不同類(lèi)型品種，水稻開(kāi)花后籽粒中直鏈淀粉與支鏈淀粉的累積變化趨 勢(shì)基本相似，大致呈“S”曲線變化。其中直鏈淀粉的累積變化在水稻開(kāi)花后5 ~ 15天最為明 顯，與此同時(shí)，籽粒中支鏈淀粉含量也在急劇增加，可見(jiàn)，水稻籽粒灌漿過(guò)程中支鏈淀粉的 合成是與直鏈淀粉的合成同時(shí)進(jìn)行的。高直鏈淀粉含量品種73 - 07與低直鏈淀粉含量品種 嘉早935相比，兩種類(lèi)型淀粉的積累趨勢(shì)均相差不大，但前者的直鏈淀粉在水稻開(kāi)花后前15 天的積累速率要明顯大于超過(guò)后者，說(shuō)明不同品種的淀粉特征差異主要表現(xiàn)在兩種類(lèi)型淀粉 的相對(duì)積累比率上。

 

1品種73-07開(kāi)花后稻米直、支鏈淀粉的變化圖2 品種嘉早935開(kāi)花后稻米直、支鏈淀粉的變化Fig. 1 Change of amylose and amylopectinFig.2 Change of amylose and amylopectin inin rice grain after anthesis ( 73 - 07，rice grain after anthesis ( Jia zao935，水稻籽粒灌漿過(guò)程中ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶與淀粉分支酶的變化 ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶(R-酶)是水稻籽粒淀粉合成代謝的32.2個(gè)關(guān)鍵酶，其中ADPG焦磷酸化酶和可溶性淀粉合成酶是水稻籽粒中淀粉生物合成的調(diào)節(jié)位 點(diǎn)，而淀粉分支酶(R-酶）的作用是通過(guò)《-1，6糖甘鍵形成而影響支鏈淀粉合成[9。通過(guò)對(duì) 水稻開(kāi)花后籽粒中這3個(gè)關(guān)鍵酶活性的動(dòng)態(tài)變化分析（圖3。圖4)，結(jié)果表明，在水稻灌漿過(guò) 程的不同時(shí)期，這3個(gè)酶的活性表現(xiàn)出明顯的差異。在水稻灌漿初期，可溶性淀粉合成酶的 相對(duì)活性較高，而ADPG焦磷酸化酶和淀粉分支酶（R-酶)在水稻籽粒灌漿初期的相對(duì)活性 則較低，這表明在水稻灌漿的起始階段，可溶性淀粉合成酶在籽粒淀粉合成代謝中起相對(duì)重 要的作用。但是隨著水稻開(kāi)花后天數(shù)的推移，可溶性淀粉合成酶的相對(duì)活性明顯降低]而 ADPG焦磷酸化酶的活性表現(xiàn)與之相反，在水稻籽粒灌漿初期相對(duì)活性較低，之后其活性迅速升高，至開(kāi)花后15天左右時(shí)其活性達(dá)到高峰值，可見(jiàn)該酶在水稻灌漿中期的作用最為活 躍；淀粉分支酶(#-酶）的活性在水稻開(kāi)花后15%20天左右達(dá)到最高，其活性高峰要明顯滯后 于ADPG焦磷酸化酶，這說(shuō)明在水稻灌漿中、后期，籽粒中支鏈淀粉的合成代謝仍相當(dāng)活躍。 而高直鏈淀粉類(lèi)型品種73- 07和低直鏈淀粉類(lèi)型品種嘉早935相比，上述3個(gè)酶在水稻籽粒 灌漿過(guò)程中的活性變化趨勢(shì)差別不明顯。

 

2.3 ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶 與淀粉分支酶活性對(duì)溫度的反應(yīng)溫度對(duì)稻米直、支鏈淀粉的含量變化有 著較大的影響，這已為前人的諸多研究結(jié)果 所闡明。為了對(duì)溫度影響稻米直鏈淀粉含量 的內(nèi)在生理特征有一更深入的認(rèn)識(shí)，本研究 分別測(cè)定了 ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉 合成酶與淀粉分支酶在20°C，25°C，30L， 35°C，40L五個(gè)不同溫度下的活性變化特征 (見(jiàn)圖5、圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADPG焦磷酸化 酶和可溶性淀粉合成酶的活性在不同溫度下 雖然有所變化，但差異不明顯，以25 % 35L 溫度范圍的酶活性稍高，這說(shuō)明上述兩個(gè)酶 的活性表現(xiàn)對(duì)溫度影響反應(yīng)相對(duì)較為遲鈍， 與之相反，淀粉分支酶(Q-酶)在不同溫度下的活性差異較大，其活性表現(xiàn)對(duì)溫度變化的反應(yīng) 則較為敏感，且淀粉分支酶的活性隨溫度變化大致呈雙峰分布，可見(jiàn)淀粉分支酶(Q-酶）的活 性變化與溫度間的關(guān)系較為復(fù)雜。上述現(xiàn)象可以說(shuō)明，在水稻籽粒淀粉合成代謝的3個(gè)關(guān)鍵酶中，淀粉分支酶（A-酶）可能是溫度對(duì)稻 米直、支鏈淀粉含量變化產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的 一個(gè)重要位點(diǎn)。高直鏈淀粉類(lèi)型品種73- 07與低直鏈淀粉品種嘉早935相比，其淀 粉分支酶(A-酶)活性隨溫度的變化趨勢(shì)基 本相似，即當(dāng)溫度為201左右時(shí)，酶的活 性處在較高的水平，隨著溫度的升高，其 活性呈明顯下降趨勢(shì)，至301左右時(shí)酶的 活件最低，之后隨著溫度的講一步h升高到351左右時(shí)，酶的活性又有一峰值出 現(xiàn)。但是高直鏈淀粉類(lèi)型品種73 - 07與低 直鏈淀粉含量品種嘉早935兩者淀粉分支 酶(Q-酶)活性，在不同溫度下的表現(xiàn)差別 在于，前者在201左右時(shí)的峰值相對(duì)高于 后者，而在351時(shí)恰好相反。由此可見(jiàn)，淀粉分支酶(Q-酶)在不同溫度下的活性表現(xiàn)也可能存在著一定的品種類(lèi)型特征。

 

表1人工氣候箱不同溫度處理下籽粒中淀粉分支酶活性的變化2.4Table 1 The changes of starch branching enzyme under the籽粒中淀粉分支酶活性different temperature treatment controlled in chamber白勺影口向開(kāi)花后時(shí)間 Days after anthesis73.-07嘉早 935 Jiazao935高溫(331， HighT. (331，適溫(231， ProperT. (231，高溫(331， High T.(331，適溫(231， ProperT. (231，54.13.45.42.715162.4171.3147.5116.22554.351.445 . 758.9利用人工氣候箱設(shè) 高溫331 (最高溫 381/最低溫281,和 適溫231 (最高溫281/最低181)2個(gè)溫度典型處理，通過(guò)對(duì)兩個(gè)品種在不同溫度下籽粒灌漿過(guò)程中淀粉分支酶的活性變化分析（見(jiàn)表1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同 溫度處理下淀粉分支酶的活性差異以水稻開(kāi)花后15天左右最明顯，低直鏈淀粉品種嘉早935 在日均溫度331下的淀粉分支酶活性要高于日均溫度231處理的活性，而對(duì)高直鏈淀粉類(lèi) 型品種73 -07而言，兩者差異不明顯。說(shuō)明水稻灌漿結(jié)實(shí)中期的較高溫度環(huán)境似乎更有利于 低直鏈淀粉類(lèi)型品種的淀粉分支酶活性發(fā)揮。

 

3討論水稻灌漿結(jié)實(shí)期間的溫度對(duì)稻米的直、支鏈淀粉的含量及比率有著顯著的影響[10。 Masaka Asaoko等人認(rèn)為稻米直鏈淀粉含量與結(jié)實(shí)期溫度呈負(fù)相關(guān)[11，但Gomez等人認(rèn)為呈正 相關(guān)[12]，而更多的學(xué)者則認(rèn)為兩者間關(guān)系與品種本身的遺傳特性有關(guān)[13~15?？傊P(guān)于二者 間的關(guān)系目前尚無(wú)定論。在以往大量研究中，多是通過(guò)研究成熟期間的表現(xiàn)型變化來(lái)探索其 影響程度的h-16。而對(duì)胚乳整個(gè)發(fā)育過(guò)程中復(fù)雜的生理生化變化及優(yōu)質(zhì)的生理特征研究則 較鮮見(jiàn)[7, 17。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水稻灌漿過(guò)程中籽粒中淀粉合成代謝有關(guān)關(guān)鍵酶如可溶性淀 粉合成酶、ADPG焦磷酸化酶和淀粉分支酶的活性變化及其溫度影響效應(yīng)，不同類(lèi)型品種之間既存在著共同的規(guī)律，也有其固有遺傳特征的差異。淀粉分支酶(！-酶)活性表現(xiàn)一般在水 稻開(kāi)花后20天左右最高，滯后于可溶性淀粉合成酶、ADPG焦磷酸化酶，而淀粉分支酶的活 性變化與溫度間的復(fù)雜關(guān)系，很可能是造成前人關(guān)于稻米直鏈淀粉含量與溫度間關(guān)系的紛亂 研究結(jié)論所在。

 

P. L. Keeling (1993 )[20)曾對(duì)小麥發(fā)育籽粒中ADPG焦磷酸化酶、UDPG焦磷酸化酶 (UDPGPPaSe)、可溶性淀粉合成酶等酶的活性與溫度間的關(guān)系作過(guò)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該酶的最 適溫度為20~25°C，溫度升高，酶活性下降(稱(chēng)“knock down”現(xiàn)象），而溫度升高對(duì)ADPG焦磷 酸化酶、UDPG焦磷酸化酶等的活性影響不大，JenneA(1993，[21]也發(fā)現(xiàn)，35：處理的小麥谷粒 30 min，其可溶性淀粉合成酶的活性下降50C。本研究通過(guò)對(duì)水稻灌漿籽粒中ADPG焦磷酸 化酶、可溶性淀粉合成酶與淀粉分支酶活性在20C，25C，30C，35C，40C五個(gè)不同溫度下 的測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)ADPG焦磷酸化酶的活性在不同溫度下表現(xiàn)較為穩(wěn)定，這與前人在小麥上 的研究結(jié)論相一致，但是在不同溫度下可溶性淀粉合成酶的活性變化，雖然在25C ~30：左 右時(shí)的活性稍高，但其活性變化幅度遠(yuǎn)不及淀粉分支酶明顯，而不同溫度下淀粉分支酶的活 性差異較大，可能是溫度對(duì)水稻籽粒淀粉合成代謝產(chǎn)生影響的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。這種現(xiàn)象是小麥與 水稻兩個(gè)不同作物間的差異，還是由于前人未在同一實(shí)驗(yàn)中對(duì)兩個(gè)酶的溫度效應(yīng)特征缺乏比 較所致，尚不清楚。值得進(jìn)一步研究。

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