黃原膠(Xanthan gum)是由野油菜黃單胞菌或其它黃單胞菌屬的菌株以碳水化合物為主要原料經(jīng)發(fā)酵 產(chǎn)生的一種胞外酸性水溶性多糖[1]。因其具有優(yōu)良的提取理化性質(zhì)[2]，從本世紀(jì)50年代后期發(fā)現(xiàn)以來，到60 年代初就開始進(jìn)行商業(yè)性生產(chǎn)。本課題主要是在前人研究的基礎(chǔ)上，以提高黃原膠的產(chǎn)量為目的，通過對(duì) 培養(yǎng)基中碳源的組成，過程參數(shù)進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)和控制的研1究，對(duì)黃原膠提取過程進(jìn)行優(yōu)化，并且通過在小 型發(fā)酵罐中進(jìn)行小試，為黃原膠的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供參考，也為以后類似的研究打下一定基礎(chǔ)。

 

1實(shí)驗(yàn)材料 1.1細(xì)菌從龍泉驛區(qū)十陵鎮(zhèn)菜園中采得十字花科植物油菜病變組織中篩選、誘變、馴化后得到的野油菜黃單胞 菌UV。

 

1.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基表1基礎(chǔ)培養(yǎng)基 Table1 Basic mediumMedia typesmedium componentsPlate mediumsucrose, 20g； yeast extract, 1g； peptone, 5g； beef extract, 3g； agar, 20g； distilled water, 1000mL； pH7.0Seed mediumsucrose, 20g； yeast extract, 1g； peptone, 5g； beef extract, 3g ； water, 1000mL； pH7.0distilledFermentationmediumsucrose, 50g； peptone, 6g； K2HPO4，5g； MgSO4 ? 7H2O, citric acid, 1g； CaCO3，3g； distilled water, 1000mL； pH7.00.3g；2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法 2.1細(xì)菌生長曲線的測定在無菌條件下，將細(xì)菌從上一級(jí)培養(yǎng)基中接種到均勻新鮮的培養(yǎng)基后，由于營養(yǎng)成分充足，細(xì)菌會(huì)以 均分裂法進(jìn)行繁殖，用血球計(jì)數(shù)板測定細(xì)菌細(xì)胞濃度。

 

2.2發(fā)酵工藝條件對(duì)產(chǎn)膠率的影響實(shí)驗(yàn)利用單因素實(shí)驗(yàn)確定黃原膠發(fā)酵的最適條件如發(fā)酵時(shí)間、碳源濃度、碳源組成[5]、接種量等。采用平 行實(shí)驗(yàn)，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，30°C，180r/mm搖瓶發(fā)酵。黃原膠提取方法：取一定量的黃原膠發(fā)酵液稀 釋3倍，加入2%的桂藻土，充分震蕩10min，4000r/min離心30min，烘干稱重。

 

2.3黃原膠提取的影響因素實(shí)驗(yàn)從提取劑、醇用量、無機(jī)鹽成分[4]、發(fā)酵液稀釋倍數(shù)幾個(gè)方面優(yōu)化黃原膠提取條件。

 

2.4黃原膠發(fā)酵小試在確定培養(yǎng)基組成和其他參數(shù)的基礎(chǔ)上，為了更好解決發(fā)酵過程中溶氧和參數(shù)控制的問題，在10L發(fā) 酵罐中進(jìn)行小試。

 

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.1細(xì)菌生長曲線的測定細(xì)菌從上一級(jí)培養(yǎng)基中接種到均勻新鮮的培養(yǎng)基后，由于營養(yǎng)成分充足，細(xì)菌會(huì)以均分裂法進(jìn)行繁殖。 由圖1可看出，0-2.5h為細(xì)菌生長延遲期；2.5-15h左右為細(xì)菌對(duì)數(shù)生長期，細(xì)菌數(shù)在此階段増加非常明顯; 15-29h為細(xì)菌生長穩(wěn)定期，此階段細(xì)菌數(shù)目基本保持不變；29h以后細(xì)菌進(jìn)入衰亡期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延 長，培養(yǎng)液中活菌數(shù)目逐漸減少。

 

圖1細(xì)菌生長曲線 Fig.1 Bacterial growth curve3.2發(fā)酵過程中產(chǎn)膠率隨時(shí)間的變化由圖2可看出，黃原膠發(fā)酵是典型的Gadenll型，前期主要為細(xì)菌生長期，后期隨著細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定生 長期，開始合成黃原膠。36-60h是黃原膠產(chǎn)膠的高峰期，此階段發(fā)酵液的產(chǎn)膠率迅速升高。60h后，膠產(chǎn) 量増加緩慢。

 

3.3發(fā)酵條件的影響3.3.1碳源濃度對(duì)產(chǎn)膠率的影響改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源蔗糖濃度，研究碳源濃度對(duì)野油菜黃單胞菌UV發(fā)酵產(chǎn)膠的影響[7]。由圖3 可看出，當(dāng)蔗糖濃度小于6°%時(shí)，隨著蔗糖濃度的増加，產(chǎn)膠率升高；當(dāng)蔗糖濃度高于6°%時(shí)，產(chǎn)膠率隨蔗 糖濃度的升高反而下降。這可能是由于當(dāng)碳源濃度較低時(shí)，對(duì)于細(xì)菌生長和產(chǎn)膠都是不足的，因而提高碳 源濃度有利于細(xì)菌生長和產(chǎn)膠；當(dāng)碳源濃度超過6%時(shí)，細(xì)菌繁殖旺盛，導(dǎo)致發(fā)酵液中細(xì)菌濃度過高，對(duì) 發(fā)酵過程中氧的消耗増加，限制了細(xì)菌產(chǎn)膠過程。所以當(dāng)碳源濃度為6%時(shí)，產(chǎn)膠率最高。

 

2345678910碳源含量(w/v)/%圖3培養(yǎng)基中碳源含量對(duì)產(chǎn)膠率的影響 Fig.3 The effection of carbon source concentration of Xanthan Gum production3.3.2碳源組成對(duì)產(chǎn)膠率的影響在固定培養(yǎng)基中其他成分不變的基礎(chǔ)上，保持碳源濃度為6°%，改變蔗糖和淀粉含量，在30°C，180r/min 條件下發(fā)酵72h，研究碳源組成對(duì)黃原膠產(chǎn)膠率的影響[8]。由圖4可看出，細(xì)菌對(duì)蔗糖的利用優(yōu)于淀粉。 從蔗糖和淀粉的組合可以看出，當(dāng)?shù)矸酆吭诳偺剂康?6.7%時(shí)，產(chǎn)膠率最高。由此可以得到細(xì)菌對(duì)蔗糖 的利用優(yōu)于淀粉，這可能是因?yàn)檎崽鞘堑途厶?，在發(fā)酵過程中能夠更快地水解為葡萄糖，滿足細(xì)菌的營養(yǎng) 需求。淀粉的存在可避免發(fā)酵液中葡萄糖濃度過高產(chǎn)生葡萄糖效應(yīng)，抑制細(xì)菌生長。

 

3.3.3接種量對(duì)產(chǎn)膠率的影響接種量與黃原膠的產(chǎn)膠率之間存在明顯的關(guān)系，由圖5可以看出，當(dāng)接種量為10%左右時(shí)，發(fā)酵的產(chǎn)膠率最高。

 

圖5接種量對(duì)產(chǎn)膠率的影響Fig.5 The effection of inoculum size of Xanthan Gum production3.4黃原膠提取的影響因素3.4.1醇種類對(duì)醇沉淀提取黃原膠的影響相對(duì)于傳統(tǒng)的使用單一有機(jī)溶劑作為沉淀劑，本實(shí)驗(yàn)嘗試采用不通比例的乙醇和異丙醇的混合溶劑來 提取。將異丙醇和乙醇按照不同比例分別混合，比較其提膠率，醇種類對(duì)提取的影響如圖6所示。由圖6 可以看出，當(dāng)醇用量一定的情況下，用混醇的提取效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用乙醇或者異丙醇。提膠率隨著混 醇中乙醇的比例増加而増加，當(dāng)乙醇：異丙醇=3: 1時(shí)，提取效果最好，繼續(xù)増加乙醇含量提膠率下降。 在乙醇中加入一定量的異丙醇可以提高提膠率，經(jīng)分析可能是異丙醇與乙醇混合后改變了溶劑的極性，使 得有機(jī)溶劑更易降低黃原膠表面的介電常數(shù)，從而使得黃原膠更易沉淀析出。而提膠量不高的是由于本次 實(shí)驗(yàn)使用的是發(fā)酵中期（40h)產(chǎn)膠率并不高的發(fā)酵液。

 

圖6不同比例混醇對(duì)提膠率的影響 Fig.6 The effection of mixing alcohol of Xanthan Gum extraction注：乙醇含量(°/。)=乙醇體積/(異丙醇體積+乙醇體積）

 

Note: ethanol content(%)=ethanol volum/( isopropyl alcohol volum +ethanol volum)

 

3.4.2醇用量對(duì)醇沉淀提取黃原膠的影響由圖7可看出，提膠率隨著醇用量的増加而提高，當(dāng)醇量為發(fā)酵液體積3倍時(shí)提膠率最高，當(dāng)醇量繼 續(xù)増加，提膠率降低。這個(gè)結(jié)果和傳統(tǒng)使用單一有機(jī)溶劑作為沉淀劑得到的結(jié)果不一致[3]，可能是由于加 入的異丙醇，水的含量也隨著醇量的増加而増加，致使黃原膠溶解増多，損失増大，降低了多糖的回收率。

 

3.4.3無機(jī)鹽對(duì)醇沉將各添加劑按等 30min (4000r/min)。

 

顯。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可 于 NaCl。

 

012345678醇用量/發(fā)酵液體積圖7不同醇用量對(duì)提膠率的影響 Fig.7 The effection of alcohol content of Xanthan Gum extraction淀提取黃原膠的影響;摩爾電荷加入己經(jīng)預(yù)處理好的發(fā)酵液中[4]，加入混醇（乙醇：異丙醇=3: 1)，離心 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，添加5種無機(jī)鹽中，加入KNO3對(duì)于提膠率的提高效果最為明 得出，KCI和NaCI對(duì)提膠量的影響差別較小，但KCI對(duì)黃原膠的膠體凝聚效果明顯優(yōu)3.4.4發(fā)酵液稀釋倍發(fā)酵72h后，發(fā) 而且還可能吸附部分圖8不同添加劑對(duì)提膠率的影響 Fig.8 The effection of different additives of Xanthan Gum extraction數(shù)對(duì)醇沉淀提取黃原膠的影響酵液十分粘稠，如果直接進(jìn)行預(yù)處理，硅藻土不能將菌體、色素及其他雜質(zhì)完全吸附， 導(dǎo)致?lián)p失。所以在預(yù)處理時(shí)，就要進(jìn)行一定的稀釋，降低膠液的粘度。

 

0.0012345678910發(fā)酵液稀釋倍數(shù)圖9發(fā)酵液稀釋倍數(shù)對(duì)提膠率的影響Fig.9 The effection of dilution ratio of fermentation broth of Xanthan Gum extraction結(jié)果如圖9所示，稀釋倍數(shù)為2-5倍時(shí)，提膠量上升較為平緩，當(dāng)稀釋倍數(shù)増大到5.5倍以后，提膠 量穩(wěn)定在2.5%發(fā)酵液，稀釋至8倍，提膠量急劇降低。因此，稀釋倍數(shù)為5.5-7倍時(shí)提膠效果最優(yōu)。

 

3.5發(fā)酵罐小試30在前期進(jìn)行搖床實(shí)驗(yàn)，確定培養(yǎng)基的組成和其他參數(shù)條件的基礎(chǔ)上，為了更好解決發(fā)酵過程中的溶氧 和參數(shù)控制的問題[6]，將發(fā)酵擴(kuò)大到10L發(fā)酵罐中進(jìn)行小試。

 

00圖10發(fā)酵過程中黃原膠的廣率、pH的變化 Fig.10 The production of Xanthan Gum and the change of pH in the fermentation process圖11發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)速與溶氧量之間的關(guān)系 Fig.11 The relationgship between stirring speed and dissolved oxygen content由圖1和圖10可知，接種后0-4小時(shí)內(nèi)菌體生長緩慢；4-15小時(shí)菌體生長進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，這時(shí)細(xì)菌代謝非常活躍，菌體大量繁殖，pH值開始下降，需不斷加堿以維持適合的pH值；20-24小時(shí)細(xì)菌進(jìn)入 穩(wěn)定期，菌體量不再上升；40小時(shí)左右菌體量開始下降。伴隨著菌體的生長，在生長期和穩(wěn)定期產(chǎn)生了大 量的多糖。由圖11可看出，到了發(fā)酵中期發(fā)酵液溶氧很難増加，但對(duì)黃原膠的產(chǎn)率影響不大。Morame[9] 等人根據(jù)實(shí)驗(yàn)也認(rèn)為溶氧在20-90%范圍內(nèi)對(duì)多糖產(chǎn)率沒有明顯影響。而且隨著黃原膠的產(chǎn)生，攪拌越來 越困難[10]，這是由于黃原膠溶液是一種典型的假塑性流體，即使是低濃度的黃原膠溶液也可形成高粘度、 非牛頓溶液[11]。

 

4結(jié)論(1) 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定，碳源濃度為6% (淀粉含量：蔗糖含量=2: 1)，接種量為10%時(shí)，細(xì)菌產(chǎn)膠率較高。

 

(2)提取黃原膠時(shí)，乙醇和異丙醇混合使用效果優(yōu)于單獨(dú)使用乙醇或異丙醇。且當(dāng)乙醇：異丙醇=3: 1時(shí) 提膠效果最好。

 

(3)加入無機(jī)鹽的提膠效果優(yōu)于不添加任何鹽類；添加KNO3的提膠量增加了兩倍以上。

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