黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的試驗(yàn)研究，黃原膠（xanthan gum),又稱漢生膠，是野油菜黃 單胞菌（lafltAcrnoflas ca即estris)以碳水化合物為主要原料，經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)的一種用途廣泛的微生物胞外多糖。黃 原膠分子由D-葡萄糖D-甘露糖，D-葡萄糖醛酸、乙 酸和丙酮酸構(gòu)成，經(jīng)發(fā)酵提取后得到的成品為白色或淺 米黃色粉末。它無味、無臭、無毒、食用安全，是 目前國際上集增稠、懸浮、乳化、穩(wěn)定于一體，性 能最優(yōu)越的生物膠。黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的試驗(yàn)研究，因其具有獨(dú)特的性質(zhì)而被廣泛地應(yīng) 用于食品、醫(yī)藥、造紙、紡織、陶瓷、日化用品、 石油開采等2 0多個(gè)行業(yè)，被譽(yù)稱為“工業(yè)味精”a I 目前，黃原膠的工業(yè)生產(chǎn)均采用間歇分批發(fā)酵的工 藝，即一次性投料，一次性出料。在整個(gè)發(fā)酵過程中， 隨著黃原膠的積累，發(fā)酵液的粘度會(huì)迅速增加，對(duì)發(fā) 酵結(jié)果造成許多不利的影響，如：溶解氧限制、發(fā)酵 產(chǎn)品質(zhì)量低、產(chǎn)膠率低等。為此，人們從新設(shè)備、新 工藝方面開展了大量地研究，來克服這些負(fù)面的影響[>4]。 本文嘗試采用分批補(bǔ)料的發(fā)酵工藝來改善間歇發(fā)酵工藝

的不足，以期望來提高發(fā)酵的最終結(jié)果。

1 材料與方法 1.1 材料

出發(fā)菌株：野油菜黃單胞菌（t/j on 〇 c a s caiupesti'is) QH79，由鄭州大學(xué)生化工程中心選育。

培養(yǎng)基：

種子培養(yǎng)基：蔗糖1%，蛋白胨0.5%,牛肉膏0. 3%, NaC10.5%, pH 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：適量淀粉水解液（見試驗(yàn)結(jié)果），蛋白 胨0.3%，豆餅粉0.2%，碳酸f丐0.3%，檸檬酸0.1%, pH7.0;

補(bǔ)料培養(yǎng)基：3.20%淀粉水解液，口117.0;13.20% 淀粉水解液，蛋白胨0.05%，pH7.0; c. 20%淀粉水解液， 蛋白胨 0. 1%, pH7. 0。

12 分析方法[5]

總糖的測定斐林法菌體濃度測定 凱氏定氮法；粘度測定 NDJ — 1型粘度計(jì)，4號(hào)轉(zhuǎn)子，3 0

轉(zhuǎn)，室溫下測定；產(chǎn)膠率測定酒精沉淀法。

1.3 培養(yǎng)方法

斜面菌種活化后，接種于種子培養(yǎng)基中，2 8 °C培 養(yǎng)16h后，以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C 培養(yǎng)3d。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中進(jìn)行補(bǔ)料試驗(yàn)，具體結(jié)果 見結(jié)果與討論。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基DE值的影響

通過前期的試驗(yàn)研究，考察了碳源、氮源、無機(jī) 鹽和pH等因素的影響，確定了間歇發(fā)酵的最適培養(yǎng)基 [5]。在試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)在淀粉、蔗糖、葡萄糖三種 碳源中，含蔗糖的培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果最好，含淀粉的培 養(yǎng)基次之，而含葡萄糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)膠極低。分析原 因，很可能是過高的還原糖濃度會(huì)抑制黃單孢菌的生 長，所以，在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中出現(xiàn)產(chǎn)膠低的 現(xiàn)象。

此外，黃單孢菌具有較強(qiáng)的胞外淀粉酶活性，使 之能夠邊水解底物邊加以利用，不會(huì)使發(fā)酵液中的還原 糖濃度過高。而蔗糖較淀粉更易水解，從而使菌體能 較快地生長，最終提高發(fā)酵結(jié)果?？紤]到蔗糖價(jià)格比 淀粉高，如利用淀粉水解液做為碳源，則既可利于菌 體的生長，又能不產(chǎn)生抑制。故試驗(yàn)首先對(duì)發(fā)酵培養(yǎng) 基的DE值進(jìn)行了考察。

利用淀粉酶水解淀粉，考察了不同水解時(shí)間下， 不同DE值對(duì)產(chǎn)膠的影響，分別以發(fā)酵液終粘度和產(chǎn)膠 率做為考察指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。從表中可以看出， 淀粉水解20min后，DE值為32. 5%,所得的水解液做為 碳源經(jīng)發(fā)酵后，發(fā)酵結(jié)果最佳，發(fā)酵液終粘度為 lOlOOc.p,產(chǎn)膠率2. 81%。

表1不同DE值對(duì)發(fā)酵的影響

Table 1 Effect of DE on fermentation

時(shí)間(h)0102030405060

DE值026.532.536.441.441.341.2

粘度(103cp)7.838.1410.18.207.407.407.43

產(chǎn)膠率(%)2.382.562.812.672.142.202.20

同時(shí)看到，水解時(shí)間的進(jìn)一步增加反而造成了發(fā)酵 結(jié)果的下降。這也進(jìn)一步表明：經(jīng)適當(dāng)水解的淀粉液因 含有適量的還原糖，使得培養(yǎng)基能更好地使菌體生長來 提高發(fā)酵結(jié)果，但過高的還原糖濃度會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生不利 的影響。

2.2 黃原膠分批補(bǔ)料的正交試驗(yàn)

分批補(bǔ)料的發(fā)酵過程中，影響發(fā)酵結(jié)果的因素很 多，主要包括：培養(yǎng)基起始碳源的濃度、補(bǔ)料培養(yǎng)基 的組成、補(bǔ)料的開始時(shí)間及補(bǔ)料的方式等等。在前面 試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，安排正交試驗(yàn)考察了各因素的影響情況

及尋找較優(yōu)的工藝條件。試驗(yàn)安排如表2

表2L9(34)正交設(shè)計(jì)因素和水平

Table 2 Factors and levels of orthogonal design L9(34)

水平A

起始碳源濃度(%)B

補(bǔ)料培養(yǎng)基C

補(bǔ)料開始時(shí)間(h)D

補(bǔ)料方式

12a24一次全加

23b36恒速流加

34c48指數(shù)流加

表中碳源均采用淀粉水解液，補(bǔ)料開始時(shí)間分別考 察了發(fā)酵培養(yǎng)24、36、48h后開始補(bǔ)料的不同時(shí)刻。補(bǔ) 料方式分三種情況，一次全加指在補(bǔ)料開始時(shí)，一次 加入剩余的培養(yǎng)基；黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的試驗(yàn)研究，恒速補(bǔ)料是從開始補(bǔ)料時(shí)刻，每隔 16h均勻加入等體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基；指數(shù)補(bǔ)料是每隔16h 采用指數(shù)流加的方式加入補(bǔ)料培養(yǎng)基。補(bǔ)料過程控制總 糖為6%，發(fā)酵時(shí)間96h。分別以發(fā)酵液終粘度和產(chǎn)膠 率為考察指標(biāo)進(jìn)行了 L9 (34)正交試驗(yàn)，結(jié)果分別見表3和 表4。

由這兩個(gè)正交試驗(yàn)可以看出，培養(yǎng)基的起始濃度、 補(bǔ)料起始時(shí)間、補(bǔ)料培養(yǎng)基成分和補(bǔ)料方式等不同因素 對(duì)黃原膠的合成有不同程度的影響。

首先，在表3中可以看到，各因素對(duì)發(fā)酵液終粘 度的影響順序分別為：起始碳源濃度>補(bǔ)料開始時(shí)間> 補(bǔ)料方式>補(bǔ)料培養(yǎng)基。

表3 發(fā)醇液粘度的正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 3Experimental results of broth viscosity

序號(hào)ABCD粘度(cp)

12a24一次全加9050

22b36恒速流加8900

32c48指數(shù)流加8360

43a36指數(shù)流加10025

53b48一次全加9450

63c24恒速流加9800

74a48恒速流加8907

84b24指數(shù)流加10333

94c36一次全加9967

M1j26310279822918328467

M2j29275286832889227607

M3j29207281272671728718

m1j87709327.397279489

m2j9758.395619630.79202.3

m3j9735.79375.78905.79572.7

Rj988.3233.7821.3370.4

在表4中，各因素對(duì)產(chǎn)膠率的影響順序分別為：補(bǔ) 料方式 > 起始碳源濃度 > 補(bǔ)料培養(yǎng)基 > 補(bǔ)料起始時(shí)間。

從試驗(yàn)結(jié)果看到，各因素對(duì)發(fā)酵液終粘度和產(chǎn)膠率 的影響是不完全一致的，這也從另一方面說明了，黃 原膠發(fā)酵的復(fù)雜性，發(fā)酵液終粘度高并不能說明產(chǎn)膠率 就高，而產(chǎn)膠率高的發(fā)酵液粘度也不一定很高。究其 原因，這和黃原膠本身分子量的大小及質(zhì)量有關(guān)。所

表4產(chǎn)膠率的正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 4 Experimental results of yield of xanthan gum

序號(hào)ABCD 產(chǎn)膠率(%)

12a24一次全加1.79

22b36恒速流加1.9

32c48指數(shù)流加2.5

43a36指數(shù)流加2.13

53b48一次全加1.53

63c24恒速流加2.13

74a48恒速流加2.08

84b24指數(shù)流加2.55

94c36一次全加2.11

M1j6.1966.475.43

M2j5.795.986.146.11

M3j6.746.746.117.18

m1j2.0622.161.81

m2j1.931.992.052.04

M3j2.252.252.042.4

Rj0.320.2570.1230.59

以，應(yīng)當(dāng)對(duì)黃原膠的發(fā)酵結(jié)果綜合考慮。通過上述正

交試驗(yàn)結(jié)果，得出了對(duì)黃原膠生產(chǎn)合成最有利的兩種排

列，并對(duì)兩種排列進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表5°

表5驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

Table 5Validation of the experimental results

序號(hào)AB CD粘度(cp) 產(chǎn)膠率(%)

13b 24指數(shù)流加110002.6

24c 24指數(shù)流加121503.01

從驗(yàn)證試驗(yàn)，可以看出試驗(yàn)2的結(jié)果較為理想，最 終可以確定該工藝條件為正交試驗(yàn)的最終結(jié)果。起始碳 源濃度為4%的淀粉水解液，因其含有適量的還原糖可 以更快地促進(jìn)菌體生長，另外，高的C/N (碳氮比）利于 產(chǎn)膠，能使黃原膠盡快積累[3]。

補(bǔ)料起始時(shí)間從發(fā)酵培養(yǎng)24h后開始為最佳，這主 要是因?yàn)辄S原膠的合成為典型的Gaden II型。在24h前 內(nèi)主要為菌體生長期，菌體在該階段己經(jīng)達(dá)到了最大 值，而24h后主要為產(chǎn)物合成期，所以在24h后補(bǔ)料不 僅滿足了菌體維持生長的需要，而且為快速合成黃原膠 提供了合成的原料。過晚補(bǔ)料，很可能會(huì)造成部分菌 體養(yǎng)料的缺乏而衰老，所以發(fā)酵24h后補(bǔ)料效果最好。

從補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分看，適量氮源的加入不僅有利 于發(fā)酵液的粘度，而且有利于最終的產(chǎn)膠率。這表明， 氮源的補(bǔ)加，對(duì)后期的黃原膠的合成有促進(jìn)作用。

補(bǔ)料方式的影響很明顯，不管從發(fā)酵液粘度還是產(chǎn) 膠率看，指數(shù)補(bǔ)加方式是最為有效的方式，采用一次 性大量補(bǔ)料方法雖然操作簡便，但這種方式會(huì)使將發(fā)酵 液瞬時(shí)大量稀釋。擾亂菌體的生理代謝，同時(shí)難于控 制過程處在最適合的狀態(tài)。采取恒速流加的方法，雖 然也比較簡單，但同樣不能保證菌體處于合適的狀態(tài)。 由于菌體生長和合成隨時(shí)間的非線性變化，采用指數(shù)補(bǔ)

料具有一定的優(yōu)越性。

2.3 分批補(bǔ)料發(fā)酵與間歇發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)比較

在不同的發(fā)酵工藝條件下，通過分析動(dòng)力學(xué)指標(biāo)， 可以更加清晰地看出兩種工藝的差別。

圖2分批補(bǔ)料發(fā)酵菌體濃度和總糖濃度變化趨勢

Fig.2 Trend of biomass concentration and total sugar concentra¬tion in fed-batch fermentation

圖1和圖2分別表示了不同工藝條件下菌體濃度和

總糖濃度隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律。二者的變化趨勢基本 相同。黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的試驗(yàn)研究，但分批補(bǔ)料的最大菌體濃度為1.15g/L，要高于 間歇發(fā)酵的菌體濃度l.〇8g/L。此外，由于分批補(bǔ)料前 期的總糖濃度較間歇發(fā)酵的低，因此，前期的C/N要 低，而較低的C/N比更加有利于菌體的生長，因此24h 前的菌體生長速度要快于間歇發(fā)酵。發(fā)酵24h后，間歇 發(fā)酵的菌體對(duì)總糖的得率系數(shù)Yx/S為0. 068,而分批補(bǔ)料 的菌體對(duì)總糖的得率系數(shù)Yx/S為0.074。所以，可以看 出，采取補(bǔ)料的方式對(duì)菌體的生長速度和生長量都有一 定的促進(jìn)作用。

圖3給出了補(bǔ)料發(fā)酵和間歇發(fā)酵兩種工藝條件下， 發(fā)酵液粘度與產(chǎn)膠率隨時(shí)間的變化趨勢。通過比較可以 看到，在發(fā)酵前期，兩種工藝條件下的發(fā)酵液粘度增 長基本一致，但后期，補(bǔ)料的發(fā)酵液粘度持續(xù)增長。

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