黃原膠寡糖酶法制備及水解酶分泌菌株的定性:
黃原膠寡糖酶法制備及水解酶分泌菌株的定性,寡糖及糖綴合物廣泛的存在于生命體內(nèi)，是重要的信息物質(zhì)，參與多種 生命活動(dòng)。寡糖由于結(jié)合位置和結(jié)合類(lèi)型的不同，種類(lèi)繁多，有著多種重要 的生物活性。黃原膠是人類(lèi)研究最為透徹、商業(yè)化應(yīng)用程度最高的由微生物 分泌的胞外多糖，而關(guān)于其降解產(chǎn)物一黃原膠寡糖是否擁有某種生物學(xué)活 性，至今少見(jiàn)報(bào)道。
首先，本文對(duì)一株從野外篩選到的分泌黃原膠酶的菌株進(jìn)行了鑒定，根 據(jù)該菌株形態(tài)特征、生理生化特征，對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步確定它 屬于鞘氨醇單胞菌（分如wgowowosO。16S rRNA序列測(cè)定結(jié)果也支持這一結(jié) 論。該菌已保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心（CGMCC NO.1421)。
其次，通過(guò)對(duì)分年.XT-11發(fā)酵條件的研究，篩選出有利于 產(chǎn)酶的各實(shí)驗(yàn)因子的適宜水平。結(jié)果表明，酶形成的適宜溫度為30°C，培養(yǎng) 基適宜起始pH值為7.0,培養(yǎng)基適宜底物濃度為1%，搖瓶發(fā)酵用250mL三 角瓶裝液30mL酶活力較高。適宜種齡為16?24h，接種量對(duì)發(fā)酵影響不大。
再次，對(duì)黃原膠寡糖在抗氧化、抑制皮膚淺部真菌、植物誘抗、抑制ACE 方面的生物學(xué)活性進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)粗酶液降解得到的粗黃原膠寡糖擁有較 強(qiáng)的抗氧化能力，而對(duì)ACE則沒(méi)有抑制作用；黃原膠寡糖還擁有了較強(qiáng)的抗 皮膚淺部真菌活性以及一定的植物誘抗活性。
最后，對(duì)鞘氨醇單胞菌XT-11紅細(xì)胞凝集活性進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)該菌懸 液能凝集2種血紅細(xì)胞。菌懸液對(duì)兔紅細(xì)胞的凝集可以被肝素所抑制。其凝 集活性不依賴(lài)于Ca2+;在pH為6.0?10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定；它的凝集活性在60 C時(shí)完全喪失。
寡糖（Oligosaccharides) —般是指由3?10個(gè)分子的單糖組成的聚合物。 在自然界中，寡糖類(lèi)與蔗糖、麥芽糖和乳糖等一般雙糖類(lèi)不一樣，很少以游 離狀態(tài)存在。寡糖及糖綴合物廣泛的存在于生命體內(nèi)，是重要的信息物質(zhì)， 參與多種生命活動(dòng)。寡糖由于單糖分子、結(jié)合位置和結(jié)合類(lèi)型的不同，種類(lèi) 繁多，功能各異，有著多種重要的生物活性。
1.1.1胃腸道活性
純寡糖是寡糖類(lèi)化合物中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一類(lèi)寡糖，但其卻具有許多重要 的生物功能。純寡糖(如乳果糖、果聚糖、大豆低聚糖、異麥芽糖、半乳糖寡 糖等)可作為一種促雙歧桿菌生長(zhǎng)因子（bifidus factor，BF)[1]。所謂促雙歧桿 菌生長(zhǎng)因子是指能促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)繁殖的一大類(lèi)天然及合成物質(zhì)，能提高 人體免疫力，使腸道內(nèi)pH值下降，抑制腸道有害菌生長(zhǎng)，產(chǎn)生B族維生素， 分解致癌物質(zhì)，促進(jìn)腸蠕動(dòng)及蛋白質(zhì)吸收。已知的這類(lèi)物質(zhì)約有20多種，半 乳糖寡糖(Galacto-oligosaccharide, GOS)就是其中最具有代表性的一個(gè)。 Shuichi Yanahara等[2]通過(guò)雙岐桿菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 GOS具有高 效、專(zhuān)一地促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)，改善動(dòng)物腸道內(nèi)菌群分布，促進(jìn)鈣的吸收， 提高食物轉(zhuǎn)化率，降低血清膽固醇含量及盲腸內(nèi)pH值等生物活性。人體攝 入適量的BF可以促進(jìn)雙歧桿菌的增值并增強(qiáng)其活性，有益于調(diào)整微生物群 落的分布。
除此以外，天然的純寡糖還有其它如供能、預(yù)防蛀牙、降低血脂及促進(jìn) 礦物質(zhì)吸收等十分重要的功能[3]。大豆低聚糖有拮抗機(jī)體過(guò)氧化損傷及降脂
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作用。果寡糖（fruco-oligosaccharide)飲用后鈣、鐵、鎂的吸收率均有上升趨
勢(shì)?；诩児烟堑纳鲜龉δ?，人們已開(kāi)發(fā)出許多寡糖類(lèi)保健食品。
某些純寡糖也有一定的副作用，如大豆低聚糖中的棉子三糖和水蘇四糖 不能被胃和腸上段的消化酶消化，而被結(jié)腸中的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)氣，引起腸胃脹 氣，被稱(chēng)為大豆脹氣因子，是大豆的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一[4]。
1.1.2增強(qiáng)造血功能活性
中藥具有純天然、副作用低等優(yōu)點(diǎn)，但成分復(fù)雜，作用機(jī)理不易闡明， 使得中藥難以得到國(guó)際公認(rèn)。目前，生物學(xué)家們主要通過(guò)提取中藥中的有效 成分來(lái)改變這種狀況。糖類(lèi)作為中藥中普遍存在的成分，成為中藥有效成分 研究的關(guān)鍵對(duì)象之一。近幾年從中藥中提取出的寡糖有效成分有很多，其中 地黃寡糖、甘草及巴戟天中的寡糖研究尤其引人矚目。
地黃低聚糖（rehmanniaglutinosa oligosaccharide，RGOS)，是從地黃多糖 中進(jìn)一步分離提取的有效成分。實(shí)驗(yàn)研究證明，GROS可以使快速老化模型 小鼠（SAMP8)的CFUS、CFU-GM和GFU-E明顯增多[5]，并且可以使外周 血中降低的WBC數(shù)明顯增加。由此提示GROS可刺激SAMP8小鼠造血干 細(xì)胞、主細(xì)胞的增殖分化。集落刺激活性實(shí)驗(yàn)顯示GROS可使小鼠體內(nèi)的集 落刺激因子產(chǎn)生明顯增多。小鼠骨髓組織學(xué)研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了 GROS 可增強(qiáng)SAMP8小鼠造血功能的作用。上述這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示GROS可以增 強(qiáng)SAMP8小鼠的造血功能。此外，GROS對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病高血糖大鼠糖代 謝尚有調(diào)節(jié)作用。
1.1.3促有絲分裂活性
甘草wra/em7+s)根的果膠多糖類(lèi)中提取出的中性低聚糖一多 羥糖酸組分，具有抗補(bǔ)體和促有絲分裂活性[6]。其中，最長(zhǎng)和最短的低聚糖 一多羥糖酸組分，具有相對(duì)強(qiáng)的抗補(bǔ)體活性，而其余所有低聚糖一多羥糖酸
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組分，僅表現(xiàn)弱的抗補(bǔ)體活性，但有顯著的促有絲分裂活性。
1.1.4抗抑郁活性
中藥巴戟天系茜草科巴戟屬植物巴戟天■丑ow)的根經(jīng) 炮制而成的傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋祛風(fēng)之功效。崔承彬等經(jīng)各種抑 郁模型篩選發(fā)現(xiàn)，巴戟天提取物有明顯的抗抑郁活性。經(jīng)進(jìn)一步萃取、透析、 凝膠柱色譜及高效液相色譜等分離手段得到4個(gè)具有顯著抗抑郁活性的寡糖 單體[7]，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1-1。
圖1-1巴戟天寡糖結(jié)構(gòu)
Figure 1-1 Structure of Morinda officinalis How oligosaccharide 1.1.5免疫增強(qiáng)活性
寡糖能在多個(gè)途徑、多個(gè)層面對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。甲殼素是N-乙?；?-D-葡萄糖胺以0-1, 4苷鍵結(jié)合而成的多糖。它是蟹、蝦、昆蟲(chóng)等的外骨骼及 蘑菇等菌類(lèi)的細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，是廣泛存在于自然界的天然高分子物質(zhì)。 它的脫N-乙?；衔锓Q(chēng)為殼聚糖。甲殼質(zhì)、殼聚糖部分酸解可分別得到幾 丁寡糖(chitin oligosaccharides)和殼寡糖（chitosan oligosaccharide)。
幾丁寡糖是指N-乙酰葡萄糖胺以P -1, 4苷鍵連接而成的3?10個(gè)單元的 低聚糖（GluNAc3-GluNAc10)。殼寡糖是D-葡萄糖胺通過(guò)1, 4鍵合而形成的 3?10個(gè)單元的低聚糖。殼寡糖具有調(diào)節(jié)激素分泌、調(diào)節(jié)人體內(nèi)pH值、增強(qiáng)
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人體免疫力的功能，且容易被人體吸收(吸收率接近100% ,是殼聚糖的數(shù)十 倍)，在改善食品結(jié)構(gòu)，提高食品保水性能方面有重要作用。此外，殼寡糖具 有能被溶菌酶分解的性質(zhì)，可以使用殼寡糖的衍生物作為醫(yī)療診斷的指標(biāo)[8]。
在醫(yī)藥方面，近年鈴木等發(fā)現(xiàn)N-乙酰殼寡六糖具有很高的抗感染、抗癌 活性；Minami等人也驗(yàn)證了殼寡糖對(duì)傷口的愈合有顯著的作用，有望成為實(shí) 用的醫(yī)用品；另外發(fā)現(xiàn)幾丁寡糖、殼寡糖還在植物生長(zhǎng)、分化及生物體抗御 方面具有信號(hào)傳導(dǎo)活性[9]。
殼寡糖作為早期腫瘤的治療藥物，具有刺激淋巴細(xì)胞攻擊癌細(xì)胞和抑制 癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能。其作用機(jī)理為乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖殘基與巨噬 細(xì)胞表面受體結(jié)合后，激活巨噬細(xì)胞釋放IL-1，同時(shí)引起T細(xì)胞表面IL-2受 體表達(dá)，而這又加速了 T細(xì)胞成熟而釋放IL-2, IL-2與受體結(jié)合后，進(jìn)一步 加速T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用[10]。
中科院大連化物所1805組用殼寡糖腹腔注射昆明種小鼠，檢測(cè)了抗體生 成細(xì)胞，血清溶血素水平，ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，遲發(fā)型超敏反應(yīng)， 試驗(yàn)結(jié)果證明，殼寡糖能顯著增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能[11]。 此外，Rina Saksena等從水牛的乳汁中提取出一種五糖寡糖，也具有重要的 免疫活性。其結(jié)構(gòu)為：GlcNAc 運(yùn)（1—3) Gal 運(yùn)（1 —4) GlcNAc 運(yùn)（1—3) Gal 3(1 —4) Glc。這種寡糖經(jīng)過(guò)處理后注入BALB / c小鼠體中，可同時(shí)誘發(fā)小 鼠產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)應(yīng)答和產(chǎn)生基于巨噬細(xì)胞數(shù)量的非特異性免疫應(yīng)答 [12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該五糖寡糖是一種免疫刺激劑。
1.1.6抗病毒活性
許多天然寡糖提取物具有重要的藥理活性。研究者根據(jù)它們的作用機(jī)理 和構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)改造修飾，可以得到一些有更好藥理活性、更低 毒副作用、更適于作為藥物使用的化合物。Kaname Katsuraya等合成的磺酸 化的寡糖有很好的抗HIV活性[13]。這些化合物是由4?6個(gè)單糖組成的羅布
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寡糖衍生物，其化學(xué)式如圖1-2。
圖1-2羅布寡糖的衍生物 Figure 1-2 Ramification of Loboligosaccharide K. Katsuraya等詳細(xì)研究了這些衍生物的合成及其構(gòu)效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)單糖數(shù) 越多，其抗HIV活性越高；寡糖的磺酸化程度越高，其活性也越高；R基團(tuán) 的碳原子數(shù)適當(dāng)提高，也使得化合物的抗HIV活性提高。最終發(fā)現(xiàn)磺酸化程 度最大的十二烷基羅布六糖寡糖具有最高的抗HIV活性和最低的細(xì)胞毒性。
1.1.7抗菌活性
早在1979年，Allan等就發(fā)現(xiàn)殼寡糖對(duì)多種微生物如真菌，藻類(lèi)和一些 細(xì)菌顯示出廣譜抗菌活性。其抗菌活性在真菌和藻類(lèi)比細(xì)菌表現(xiàn)的更為直接。 研究表明，殼寡糖對(duì)大多數(shù)的植物病原真菌孢子萌發(fā)形成菌絲體和細(xì)菌的生 長(zhǎng)均有一定程度的直接抑制作用，但不同性質(zhì)的殼寡糖或?qū)Σ煌牟≡?其抑制強(qiáng)度有很大的差異[14]。
殼寡糖的抗菌作用主要通過(guò)兩種途徑實(shí)現(xiàn)：一種是殼寡糖通過(guò)吸附在細(xì) 胞表面，形成一層高分子膜，阻止了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，從而起到抑 菌、殺菌的作用；另一種機(jī)理是殼寡糖通過(guò)滲透進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，吸附細(xì)胞體 內(nèi)帶有陰離子的細(xì)胞質(zhì)，并發(fā)生凝絮作用，擾亂細(xì)胞正常的生理活動(dòng)，從而 殺滅菌種[15]。不僅殼寡糖具有抑菌活性，許多由微生物胞外分泌的多糖降解 得到的寡糖類(lèi)物質(zhì)也具有較強(qiáng)的抗菌性，比如黃原膠寡糖(oligoxanthan)對(duì)番 茄早疫病菌等植物致病真菌具有較強(qiáng)的抑制。
Ziracin也是一種神奇的寡糖類(lèi)藥物，它是由2個(gè)原酸酯、1個(gè)硝基糖、1
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個(gè)亞甲基二氧基團(tuán)和2個(gè)芳香酯殘基構(gòu)成的整個(gè)分子包含35個(gè)手性原子[16] 的化合物。Ziracin和扁枝衣霉素、居拉霉素、阿維霉素等都是屬于晚霉素抗 菌素家族，而且是開(kāi)發(fā)用于人類(lèi)的晚霉素抗菌素家族的惟一成員。作為抗菌 素類(lèi)藥物，Ziracin還有其獨(dú)特之處，它不但對(duì)抵抗革蘭氏陽(yáng)性菌有很高的活 性，而且對(duì)耐甲氧西林的葡萄球菌素、耐萬(wàn)古霉素的腸球菌素也有很高的活 性。雖然在Ziracin第二及第三階段的研究中出現(xiàn)安全問(wèn)題，使得Ziracin沒(méi) 有成為藥物，但這也為以后開(kāi)發(fā)抗菌素提供了新思路。
1.1.8抗炎活性
炎癥反應(yīng)的起始過(guò)程是由選凝素（selectin), —種能與碳水化合物結(jié)合的 受體所調(diào)控的[17]。選凝素是一類(lèi)處于細(xì)胞表面的生物受體，它能特異性的識(shí) 別寡糖分子，并與之結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的選擇性結(jié)合。目前發(fā)現(xiàn)的與免疫 反應(yīng)有關(guān)的選凝素共有3種類(lèi)型：E2, P2, L2選凝素[18]。動(dòng)物模型顯示所 有3類(lèi)選凝素均在急、慢性炎癥中發(fā)揮作用，但作用條件卻有所不同。研究 發(fā)現(xiàn)一類(lèi)同時(shí)能被3類(lèi)選凝素識(shí)別的四糖結(jié)構(gòu)sLex與sLea，這兩種寡糖的區(qū) 別僅在于它們分子中半乳糖基和巖藻糖基與N-乙酰氨基葡萄糖的連接方式 不同，但其空間取向相似。雖然sLex與選凝素在體外結(jié)合較弱，但其的確具 有顯著的抗炎效果，現(xiàn)已進(jìn)入臨床[19]。
1.1.9抗凝血活性
聚陰離子寡糖有著良好的抗凝活性。研究發(fā)現(xiàn)了大量副作用較小的抗凝 劑，其中以低分子量肝素(LMWH)最為突出，此外還有硫酸軟骨素B、合成 二麥芽糖酰胺酸及與抗凝血酶III (ATIII)結(jié)合的肝素五糖等。肝素與ATIII結(jié) 合的部分為一獨(dú)特的五糖結(jié)構(gòu)，約占自然肝素的1 /3以下，稱(chēng)為核心五糖[20]。 當(dāng)?shù)头肿恿扛嗡?包括核心五糖)與ATIII結(jié)合，后者被激活，直接與凝血酶 Xa因子作用產(chǎn)生抗凝作用。當(dāng)在普通肝素存在下，除凝血酶Xa因子以外，
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Ila因子還可與肝素和ATIII形成的復(fù)合物結(jié)合，同時(shí)產(chǎn)生抗凝活性和出血副 作用[21]。所以LMWH與許多寡糖有較小的副作用。寡糖保持了較好的抗凝 活性，副作用又小，而且它有了合成的可能性，可以得到單一化合物，符合 當(dāng)今藥物開(kāi)發(fā)的大趨勢(shì)。
1.1.10其他活性
肝素是一種高硫酸化、復(fù)雜、多分散的線形糖胺聚糖（GAG)，其摩爾 分子質(zhì)量范圍為5X103?4X104。經(jīng)化學(xué)解聚或酶催化解聚肝素可得到低分 子量肝素(LMWH)及肝素寡糖，肝素寡糖仍然是不均勻聚合物的混合物，其 分子量分布為(2?8)X103。但與肝素相比，肝素寡糖藥理學(xué)分布曲線得到改 善，表現(xiàn)出較好的抗血栓活性和其它生物藥效，并且減少了副作用，因此近 年來(lái)肝素寡糖得到廣泛研究[22]。LMWH已被證明是預(yù)防DVT安全而有效的 藥物，目前正在進(jìn)行新的適應(yīng)性研究，其中之一是對(duì)于變態(tài)反應(yīng)性哮喘的病 人吸入LMWH可以改善其肺功能，超低分子肝素被認(rèn)為能夠抑制冠狀和外 周動(dòng)脈硬化的形成[23, 24]。
寡糖作為一種天然的高分子物質(zhì)，廣泛存在于自然界之中，來(lái)源十分豐 富。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、藥學(xué)、現(xiàn)代分析化學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域的飛速發(fā) 展，寡糖類(lèi)物質(zhì)所具有的眾多其他物質(zhì)無(wú)可比擬的生物活性逐漸吸引了人們 的目光。在如今科技高速發(fā)展的21世紀(jì)，該類(lèi)物質(zhì)的研究、開(kāi)發(fā)與利用必將 具有更加廣闊的前景。
1.2黃原膠簡(jiǎn)介
黃原膠（xanthan gum)是二十世紀(jì)五十年代美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方研究室 (Northern Regional Research Laboratories，NRRL)，從野油菜黃單孢菌
決owo肌s1 ca—e你^ ) NRRL B-1459中發(fā)現(xiàn)的分泌的中性水溶性多糖，
又稱(chēng)為漢生膠。
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黃原膠是一種由重復(fù)單位組成的高分子多糖（圖1-3 )。黃原膠中存在 的糖為D-葡萄糖、D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸。葡萄糖以P-1，4-鍵連接，形 成葡聚糖纖維素骨架。間隔的葡萄糖基有一短的支鏈，這條支鏈?zhǔn)怯?個(gè)葡 萄糖醛酸插到2個(gè)甘露糖單位中所組成，所以側(cè)鏈組成為P-D-甘露糖-(1，4) -P-D-葡萄糖醛酸-(1，2) - a-D-甘露糖。末端甘露糖部分可以在4位和6位 連接丙酮酰殘基。內(nèi)部的甘露糖單位C6位乙?；?。側(cè)鏈上連接的乙酰基和 丙酮酰殘基的量的變化取決于黃原膠是由哪一類(lèi)野油菜黃單胞菌中分離得到 的，丙酮酸的含量的變化同樣與發(fā)酵條件有關(guān)。平均約半數(shù)的末端甘露糖攜 帶有丙酮?；；鸵阴；臄?shù)量和位置使原本非常有規(guī)律的結(jié)構(gòu)呈 現(xiàn)出不規(guī)律性。
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1.2.1黃原膠的性狀
黃原膠為乳白、淡黃至淺褐色顆?；蚍勰铙w，微臭。易溶于水，水溶 液呈中性，為半透明體。低濃度水溶液的黏度也很高，如0.5%溶液的黏度為
0.4Pa.s。在水溶液中，黃原膠分子的側(cè)鏈緊緊纏繞著纖維素主鏈，所以黃原 膠溶液有很強(qiáng)的耐酸、耐堿、抗生物酶降解和耐熱的性能，因此其黏度不受 pH值和溫度變化的影響。其黏度也不受蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等影響。 在水溶液中，黃原膠分子的側(cè)鏈帶有負(fù)電荷，具有很強(qiáng)的結(jié)合陽(yáng)離子的能力， 使得陽(yáng)離子不能作用于主鏈，因此，黃原膠溶液的黏度不受鹽的影響。溫度 不變時(shí)，受機(jī)械力的作用，可發(fā)生溶膠與凝膠的可逆變化。攪拌可使溶液的 黏度下降。靜置則又升高（牛頓塑性）。黃原膠能溶于多種酸溶液，如5% 的硫酸、10%的鹽酸和25%的磷酸，且這些黃原膠酸溶液在常溫下相當(dāng)穩(wěn)定， 數(shù)月之久仍不變。黃原膠也能溶于氫氧化鈉溶液，并具有增稠特性，所形成 的粘溶液在室溫下十分穩(wěn)定。
1.2.2黃原膠的性能
黃原膠水溶液的黏度幾乎不受溫度、酸堿度和鹽類(lèi)的影響[27]，因此它是 食品的良好增稠劑。黃原膠溶膠分子能形成超結(jié)合帶狀的螺旋共聚體，構(gòu)成 脆弱的類(lèi)似膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所以能夠支持固體顆粒、液滴和氣泡的形態(tài)，顯 示出很強(qiáng)的乳化穩(wěn)定作用和高懸浮能力。
黃原膠與海藻酸鈉、淀粉等增稠劑能很好地互溶，故可復(fù)配使用。與卡 拉膠、槐豆膠、瓜膠有協(xié)同效應(yīng)，與卡拉膠復(fù)配使用可提高彈性，與槐豆膠 或瓜膠復(fù)配使用可提高黏性[28, 29]。
1.2.3黃原膠的應(yīng)用
黃原膠由于其獨(dú)特的剪切稀釋性質(zhì)，良好的增稠性，理想的乳化穩(wěn)定性， 對(duì)酸、堿、熱、反復(fù)凍融的高度穩(wěn)定性，以及對(duì)人體的完全無(wú)毒害等許多優(yōu)
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良的特性，因而在食品、石油、醫(yī)藥、日用化工等十幾個(gè)領(lǐng)域有著極其廣泛 的應(yīng)用，其商品化程度之高，應(yīng)用范圍之廣，令其他任何一種微生物多糖都 望塵莫及?，F(xiàn)略舉一二。
1)食品方面
許多食品中都添加黃原膠作為穩(wěn)定劑、乳化劑、懸浮劑、增稠劑和加工 輔助劑。黃原膠可控制產(chǎn)品的流變性、結(jié)構(gòu)、風(fēng)味及外觀形態(tài)，其假塑性又 可保證良好的口感，因此被廣泛應(yīng)用于色拉調(diào)料、面包、奶制品、冷凍食品、 飲料、調(diào)味品、釀造、糖果、糕點(diǎn)、湯料和罐頭食品中。近年來(lái)，較發(fā)達(dá)國(guó) 家的人們往往擔(dān)心食品中的熱值過(guò)高而使自己發(fā)胖，黃原膠由于其不可被人 體直接降解而打消了人們的這一顧慮。此外，據(jù)1985年日本的報(bào)道，對(duì)十一 種食品添加劑進(jìn)行對(duì)比測(cè)試，黃原膠是其中最為有效的抗癌試劑。
2)日用化工方面
黃原膠分子中含有大量的親水基團(tuán)，是一種良好的表面活性物質(zhì)， 并具有抗氧化、防止皮膚衰老等功效，因此，幾乎絕大多數(shù)高檔化妝品 中都將黃原膠作為其主要功能成分。此外，黃原膠還可作為牙膏的成分 實(shí)質(zhì)增稠定型，降低牙齒表面磨損。
3)醫(yī)學(xué)方面
黃原膠可以作為控釋劑用于制藥行業(yè)。凝膠化黃原膠微球?qū)⒒钚猿煞职?裹在內(nèi)，這種微球在干燥狀態(tài)下被吞咽，在胃中膨脹，進(jìn)而逐漸釋放出活性 成分活性分子同樣可以與多糖共價(jià)結(jié)合，然后在體內(nèi)水解酶的作用下逐漸釋 放；由于其自身的強(qiáng)親水性和保水性，還有許多具體醫(yī)療操作方面的應(yīng)用， 如可形成致密水膜，從而避免皮膚感染；減輕病人放射治療后的口渴等。此 外，李信、許雷曾撰文指出，黃原膠本身對(duì)小鼠的體液免疫功能具有明顯的 增強(qiáng)作用網(wǎng)。
4)工農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用
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黃原膠最重要的工業(yè)應(yīng)用在于石油鉆探。在這個(gè)應(yīng)用中，由于黃原膠的 假塑性行為、溫度穩(wěn)定性以及耐鹽性，使得其非常有用。黃原膠在石油生產(chǎn) 中的應(yīng)用已由Pettit和Kan進(jìn)行了綜述。在石油鉆探中，鉆頭上要求有低黏 度，而在環(huán)形套筒上則要求有高黏度，因此含有黃原膠的鉆探液體允許鉆頭 快速穿透，而在環(huán)形套筒則為鉆粉懸浮液[27]。
在織物印染上，通過(guò)阻止染料的遷移，黃原膠賦予了織物印花特殊的流 變學(xué)性質(zhì)，而這種流變學(xué)性質(zhì)對(duì)制備圖案明晰而規(guī)則的產(chǎn)品是必需的。黃原 膠能與大多數(shù)印染材料相容，并且很容易經(jīng)過(guò)洗滌去除。黃原膠還可用于陶 瓷釉料，其能阻止不同組分的凝聚作用。
人們對(duì)黃原膠的發(fā)現(xiàn)以及隨后對(duì)其結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行的大量研究，觸發(fā)了人 類(lèi)對(duì)微生物多糖優(yōu)良的性質(zhì)的強(qiáng)烈好奇，引發(fā)了發(fā)酵史上不小的轟動(dòng)。迄今 半個(gè)世紀(jì)已過(guò)，人們依然沒(méi)有降低對(duì)黃原膠的研究熱情（據(jù)估計(jì)，全世界對(duì) 黃原膠的需求量每年以7%?8%的速度增長(zhǎng)，僅從世界石油組織分析結(jié)果顯 示，近期世界石油行業(yè)鉆井和三次采油方面需要黃原膠將達(dá)90萬(wàn)噸/年?100 萬(wàn)噸/年），隨著研究的進(jìn)一步深入以及生產(chǎn)工藝的進(jìn)一步改進(jìn)，黃原膠應(yīng)用 潛力仍然很大。
1.3黃原膠的生物合成
黃原膠的合成，從五元糖重復(fù)單位的裝配開(kāi)始，然后這些重復(fù)單位聚合 生成大分子。這些黃原膠寡糖重復(fù)單位是通過(guò)來(lái)自于高能糖核苷酸的單糖的 按序添加形成的。高能糖核苷酸包括乙酰輔酶A和磷酸烯醇式丙酮酸。來(lái)自 于內(nèi)膜的多萜醇磷酸鹽作為受體[31]。五元糖裝配的第一步是UDP-葡萄糖上 1-磷酸糖基轉(zhuǎn)移到多萜醇磷酸鹽上，然后再逐個(gè)的按序?qū)⑵渌菤埢D(zhuǎn)移上 去，D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸分別來(lái)自GDP-甘露糖和UDP-葡萄糖醛酸，從 而得到完整的與脂相連接的五元糖重復(fù)單位。乙酰基和丙酮?；窃谶@個(gè)與 脂連接的五糖階段添加的，其分別由乙酰輔酶A和磷酸烯醇式丙酮酸提供。
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與內(nèi)部甘露糖殘基相連的O-乙?；约斑B接在末端甘露糖上丙酮酸的數(shù)目 會(huì)發(fā)生很大的變化，這取決于菌株及發(fā)酵條件。黃原膠鏈的增長(zhǎng)發(fā)生在還原 末端（如圖1-4)。生物合成的最后一步，是將黃原膠從細(xì)胞膜上分泌出去。 穿過(guò)周質(zhì)和外膜分泌到胞外環(huán)境的過(guò)程還沒(méi)有得到完全的闡述。這個(gè)運(yùn)轉(zhuǎn)的 過(guò)程需要能量，并且可能是通過(guò)一個(gè)特殊的運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)保證將高聚 物從脂類(lèi)載體上釋放出來(lái)并且進(jìn)行跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)[32]。
圖1-4黃原膠的生物合成 Figure 1-4 Biosynthesize of xanthan gum
Ac-乙酰基；Glc-葡萄糖；Man-甘露糖；P-磷酸鹽; PEP-磷酸烯酮式丙酮酸；Pyr-丙酮酸
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gumB〉gumC〉gumD〉gumE〉gumF〉gumG〉gumH〉gumI〉gumJ〉gumK〉gumL〉gumM〉
t
圖1-5野油菜黃單胞菌生物合成中黃原膠操縱子的遺傳圖譜
Figure 1-5 Genetic map of xanthan gum operon in Xantho'mo'nas cam^estri
biosynthesize
參與黃原膠生物合成的許多基因已被鑒定、分離和表征（如圖1-5)。在 野油菜黃單胞菌致病變種（Xanthomonascampestrispv.campestris)中，黃原 膠的生物合成由一個(gè)12個(gè)基因組成的基因簇(叢gumB到gumM)指導(dǎo)[33, 34]。 單糖的轉(zhuǎn)移和脂質(zhì)中間體乙?；孕纬赏暾囊阴；貜?fù)單位，需要7個(gè)基 因產(chǎn)物的參與。這個(gè)基因簇并不與合成糖核苷酸前體所需要的基因相連。這 個(gè)基因簇的12個(gè)基因以單一操縱子的形式從第一個(gè)基因上游的啟動(dòng)子開(kāi)始 表達(dá)。黃原膠的合成看起來(lái)并沒(méi)有受到特別的控制，但實(shí)際上，至少這個(gè)基 因簇中的5個(gè)基因產(chǎn)物對(duì)黃原膠合成起著活化作用。Pollock等（1997)克隆 了鞘氨醇單胞菌（分hi+ngomonas)中編碼黃原膠的裝配、乙酰化、丙酮酰化、 聚合和分泌的12個(gè)基因，這些基因?qū)τ邳S原膠的合成已經(jīng)足夠。來(lái)源于重組 微生物的黃原膠與天然的黃原膠在結(jié)構(gòu)和功能上沒(méi)有什么分別[35]。
1.4黃原膠的降解
黃原膠是一種高聚合度的微生物多糖類(lèi)物質(zhì)，根據(jù)其分子量不同應(yīng)用在 不同的領(lǐng)域。當(dāng)其以高聚合度狀態(tài)存在，往往利用其高粘度及較高的穩(wěn)定性 等物理性質(zhì)應(yīng)用在食品、化工和醫(yī)藥等領(lǐng)域。然而黃原膠超乎尋常的穩(wěn)定性 本身也是一把雙刃劍，在增加其普及度的同時(shí)也產(chǎn)生了一些問(wèn)題。比如在采 油業(yè)中，由于使用黃原膠而增加了溶液的粘度，從而大大增加了后續(xù)工藝如 油料運(yùn)輸及產(chǎn)品純化的成本。唯有將其降解才能使對(duì)黃原膠的應(yīng)用做到“進(jìn) 可攻，退可守”。
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隨著分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，寡糖的生物活性引起了研究者的矚目， 因而造就了目前寡糖工程在國(guó)際上競(jìng)相研究、炙手可熱的局面。由植物致病 菌分泌的黃原膠所降解的寡糖是否也擁有某種生物活性的疑問(wèn)也激起了人們 強(qiáng)烈的興趣。隨之而來(lái)的問(wèn)題就是降解，如何降解，降解到何種程度。
盡管黃原膠的主鏈與纖維素相同，但由于規(guī)則的螺旋結(jié)構(gòu)的保護(hù)，以及 側(cè)鏈所產(chǎn)生的位阻，使得一般的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶等 都很難將其降解。多糖的降解，通?？捎盟幔ㄈ琨}酸、次氯酸）或強(qiáng)氧化劑 (如過(guò)硼酸鈉、過(guò)硫酸銨），盡管這在實(shí)驗(yàn)室效果不錯(cuò)，但在實(shí)際應(yīng)用中效果 不理想。
1980年，M.Rinaudo等人第一次報(bào)道用一種纖維素酶對(duì)處于不規(guī)則構(gòu)象 的黃原膠主鏈進(jìn)行隨機(jī)降解，然而，對(duì)于一般規(guī)則的螺旋構(gòu)象的黃原膠而言， 該酶幾乎沒(méi)有降解作用。隨后，1981年，Cripps等人的研究小組發(fā)現(xiàn)了一種 能以黃原膠為唯一碳源生長(zhǎng)的土壤棒狀桿菌，命名為NCIB11535。用薄層層 析分析其降解產(chǎn)品，降解產(chǎn)物有九種，而對(duì)于脫乙酰的黃原膠而言，降解產(chǎn) 物只有四種，分別是甘露糖，甘露糖與丙酮酸的縮酮產(chǎn)物，以及兩種寡糖產(chǎn) 品（專(zhuān)利 WO0030393)。
Ruijssenaars等（1999)在一株類(lèi)芽孢桿菌（Paew+toc///狀）中發(fā)現(xiàn)了幾
種能降解黃原膠的酶。這株菌的酶能夠降解約整個(gè)黃原膠分子的1/3,而不會(huì) 攻擊其分子骨架[36]。最近，日本京都大學(xué)的Murata等人詳細(xì)報(bào)道了用一株芽 孢桿菌降解黃原膠的途徑（如圖1-6)。降解黃原膠所需要的酶有黃原膠水解 酶、葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖醛酸水解酶以及甘露糖苷酶。由于胞外 黃原膠水解酶的作用，降解首先開(kāi)始于黃原膠側(cè)鏈上丙酮?；母事短桥c 葡萄糖醛酸殘基之間糖苷建的斷裂；接著黃原膠受到胞外P-D-葡聚糖酶的攻 擊，產(chǎn)生一個(gè)四元糖，這個(gè)四元糖就是沒(méi)有末端甘露糖殘基的黃原膠重復(fù)單 位；然后，這個(gè)四元糖被帶入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，被P-D-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生不
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飽和的葡萄糖醛酸-乙酰甘露糖-葡萄糖三糖；隨后，葡萄糖醛酸水解酶水解 產(chǎn)生一個(gè)不飽和的葡萄糖醛酸和甘露糖-葡萄糖雙糖；降解的最后一步是a- 甘露糖苷酶將雙糖水解為甘露糖和葡萄糖[37, 38]。
HOH2CHOH2C一
。義O?苫0,
HO OHOH
n
COOH
I
H3C—C、
3OH2C
O.—'
HO
HOH2C
OH
ACOH2〇O
HO '
HOH2C
HO '
?
O
n
HO
圖1-6芽孢桿菌降解黃原膠途徑 Figure 1-6 Xanthan depolymerization pathway in Bacill^us sp. strain
有關(guān)微生物黃原膠側(cè)鏈酶的基因克隆和結(jié)構(gòu)研究代表了這一領(lǐng)域最新、 最重要的進(jìn)展。通過(guò)將黃原膠側(cè)鏈酶的基因克隆到適于工業(yè)化生產(chǎn)的宿主細(xì) 胞，可以使黃原膠側(cè)鏈酶的發(fā)酵產(chǎn)率得到大幅度提高。此外，對(duì)黃原膠側(cè)鏈
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酶結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解為基因的克隆提供了必要信息的同時(shí)，使合適的酶在工業(yè) 化生產(chǎn)中得到應(yīng)用成為可能。毫無(wú)疑問(wèn)，微生物黃原膠側(cè)鏈酶的基因克隆對(duì) 酶的生產(chǎn)和黃原膠寡糖結(jié)構(gòu)鑒定方面有著深遠(yuǎn)的影響。
1.5降解黃原膠菌株的簡(jiǎn)介
鞘氨醇單胞菌（分如WgOWOWOS1年.）是一類(lèi)有著重要商業(yè)應(yīng)用前景的細(xì)菌。 從形態(tài)上看，主要為球菌和桿菌，并且均為需氧的革蘭氏陰性菌。鞘氨醇單 胞菌在自然界分布廣泛，從土壤、河水、深層堆積物、血液、傷口等處均可 分離得到。在與植物相關(guān)的環(huán)境中（如根的周?chē)┌l(fā)現(xiàn)的最多。近來(lái)報(bào)道， 這類(lèi)細(xì)菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等與人類(lèi)密切相關(guān)的領(lǐng)域里應(yīng)用價(jià)值很高。比 如它們可以降解不熔的污染物，可以作為植物致病真菌的抑制劑還可以分泌 具有高附加值的胞外多糖如瓜膠等[39]。
基于16S rRNA同源序列分析，該類(lèi)細(xì)菌在蛋白菌的a-4亞基中形成系 統(tǒng)連接緊密的集團(tuán)[40]。盡管有些鞘氨醇單胞菌不運(yùn)動(dòng)、不發(fā)酵，但是幾乎所 有該屬的細(xì)菌都包含一個(gè)類(lèi)似于“標(biāo)簽”一樣的結(jié)構(gòu)，即，含有18?21個(gè)碳 的直鏈飽和二氫鞘氨脂、單不飽和二氫鞘氨脂以及含有環(huán)丙烷的二氫鞘氨脂。 除此之外，它們還擁有一個(gè)可以利用苯醌的長(zhǎng)鏈及十個(gè)類(lèi)異戊二烯單元的側(cè) 鏈。DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌G+C含量大約為61%?67%[41]。 鞘氨醇單胞菌的外膜結(jié)構(gòu)比較特殊，包括鞘糖脂，缺少脂、氨連接的三羥基 脂肪酸并且缺乏脂多糖成分或者具有革蘭氏陰性菌特征的成分。
一般來(lái)說(shuō)，微生物是靠分泌降解酶降解生物高分子進(jìn)而攝入降解產(chǎn)物而 生存的。而鞘氨醇單胞菌的作用機(jī)制似乎不太一樣，它是通過(guò)一種類(lèi)似于“吞 噬作用”來(lái)利用胞外多糖的。鞘氨醇單胞菌的細(xì)胞表面被數(shù)量巨大且結(jié)構(gòu)復(fù) 雜的辨狀物所覆蓋。Murata等發(fā)現(xiàn)[42]在褐藻多糖的存在下細(xì)胞表面形成了類(lèi) 似于嘴狀的凹陷，而褐藻多糖則集中在凹陷周?chē)?。顯示了細(xì)胞膜陷入細(xì)胞質(zhì)
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這樣特殊的結(jié)構(gòu)。由于多糖酶僅僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，甚至不會(huì)分泌到周質(zhì)中， 所以其機(jī)理可能是靠細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的（如圖1-7)。對(duì)于革蘭氏陰 性菌，膜的內(nèi)部是立體選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，外部是非立體特異性多孔結(jié)構(gòu)適合 轉(zhuǎn)運(yùn)低分子的底物。而高分子物質(zhì)如蛋白、多糖是通過(guò)其他機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。
圖1-7鞘氨醇單胞菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu) Figure 1-7 Cell structure of Sphingomonas sp.
I圖：在褐藻多糖存在下，鞘氨醇單胞菌表面形成的嘴狀結(jié)構(gòu)（發(fā)酵時(shí)間：A， 0h； B，2h； C，7h； D，14h； E，20h； F，24h)
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II圖：褐藻多糖在細(xì)胞表面的定位（A，褐藻多糖缺失條件下細(xì)胞的生長(zhǎng)；B,
褐藻多糖存在的條件下細(xì)胞的生長(zhǎng)）
III圖：褐藻多糖存在條件下生長(zhǎng)細(xì)胞的一部分（箭頭處為嘴狀凹陷）
將土樣懸浮于滅菌后的生理鹽水中，并進(jìn)行梯度系列稀釋后，按常規(guī)方 法涂黃原膠平板，于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。分別挑出單個(gè)菌落的一部 分接種于黃原膠平板，于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，作為保留菌種；另一部 分接種于選擇性液體培養(yǎng)基，并于30C振蕩培養(yǎng)(200 r/min)，觀察培養(yǎng)基的 粘度變化。經(jīng)對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液下降程度和速度的比較，選出一株對(duì)黃原 膠降解能力最強(qiáng)的菌落作為研究用菌，命名為XT-11[1]。
2.2分泌黃原膠酶菌株的常規(guī)鑒定
細(xì)菌的常規(guī)鑒定法，在著重于細(xì)菌的表觀特征描述的基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué) 分類(lèi)、數(shù)值分類(lèi)等各個(gè)方面進(jìn)行鑒定。用于進(jìn)行鑒定的菌株首先必須為純菌。 通常所說(shuō)的純菌，一般是菌落形態(tài)一致、菌體細(xì)胞形態(tài)一致的菌株。其次要 求菌種必須生長(zhǎng)代謝活躍，處于休眠或衰退的菌種則不適于此種鑒定。雖然 細(xì)菌的常規(guī)鑒定方法比較傳統(tǒng)，耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目較多，比較 復(fù)雜，但由于該方法能從多個(gè)方面對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分析，故一直被用來(lái)進(jìn)行細(xì)菌 鑒定。
2.2.1形態(tài)特征
試驗(yàn)方法：
采用革蘭氏染色，待鑒定菌株于黃原膠液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)12?36小 時(shí)，光學(xué)顯微鏡下觀察個(gè)體形態(tài)并測(cè)定菌體大小。同時(shí)用上述培養(yǎng)物，采用 電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)、鞭毛著生情況和細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)；于牛肉膏瓊脂、
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營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB瓊脂、蛋白胨酵母膏瓊脂等4種固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48 小時(shí)后觀察菌落的顏色和形態(tài)并測(cè)定菌落大小[2,3]。
結(jié)果與討論：
對(duì)分離到一株能夠分泌降解黃原膠酶的菌株XT-11，在光學(xué)顯微鏡下觀 察發(fā)現(xiàn)(圖2-1)，該菌株在幼齡時(shí)期為桿菌，大小約為0.4?0.6pmx1.0?2.0pm，
呈直桿形或稍彎曲，但在1周以上的培養(yǎng)物中，只存在0.5pmx0.5pm左右的 類(lèi)球狀細(xì)胞。負(fù)染電鏡照片顯示其側(cè)生鞭毛（圖2-2)。革蘭氏染色陰性，抗 酸性染色陰性。
XT-11菌株于固體平板培養(yǎng)基上30 C培養(yǎng)2?4天，菌落呈圓形，凸起， 較光滑，乳白色，濕潤(rùn)，不透明，邊緣完整。
圖2-1 XT-11桿狀與球狀菌體形態(tài)圖2-2 XT-11的負(fù)染電鏡掃描照片
Figure 2-1 Rod and round cell of strain XT-11
Figure 2-2 Electron micrograph of negative-stained XT-11 cell
2.2.2運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)
試驗(yàn)方法：
運(yùn)動(dòng)性檢查采用兩種方法進(jìn)行。一種是在檢查葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)， 通過(guò)半固體穿刺同時(shí)進(jìn)行，另一種通過(guò)水浸片法檢查[4]。水浸片法具體操作 如下：在LB液體培養(yǎng)基中將XT-11菌株于30C振蕩(150 r/min)培養(yǎng)24小時(shí)
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后，取1滴菌懸液置于載玻片上,加蓋蓋玻片后直接在高倍鏡下觀察。觀察到 快速移動(dòng)的菌體則表明待測(cè)菌株具有運(yùn)動(dòng)能力。
結(jié)果與討論：
XT-11菌株屬于兼性厭氧菌，按Cappuccino的方法[4]，在整個(gè)瓊脂試管
中基本呈均勻生長(zhǎng)；半固體穿刺培養(yǎng)和懸滴鏡檢結(jié)果表明該菌體無(wú)運(yùn)動(dòng)性。
2.2.3生長(zhǎng)條件試驗(yàn)
試驗(yàn)方法：
用721型分光光度計(jì)在660 nm處測(cè)量最適鹽濃度、最適溫度和最適pH 等的生長(zhǎng)情況。
結(jié)果與討論：
XT-11菌株僅能在40 mg/L以下濃度的NaCl上生長(zhǎng)；其生長(zhǎng)溫度范圍為 12 °C?35 °C，最適生長(zhǎng)溫度為30 °C。其生長(zhǎng)的pH范圍為4-8，最適pH為 7.5。
2.2.4芽孢試驗(yàn)
試驗(yàn)方法：
采用水浴80 C保溫10 min或用與培養(yǎng)液等量的95%乙醇于20 C保溫 45 min的處理方法檢驗(yàn)芽孢是否存在。
結(jié)果與討論：
經(jīng)水浴80 C保溫10 min或乙醇處理后，XT-11菌株不能生長(zhǎng)，說(shuō)明無(wú)芽 孢生成。
2.2.5碳源的利用
試驗(yàn)方法：
硫酸銨2 mg/L，磷酸二氫鈉5 mg/L，磷酸氫二鉀0.5 mg/L，七水合硫酸鎂
0.2 mg/L，氯化鈣0.1 mg/L。分別添加葡萄糖、鹿糖、麥芽糖、乳糖、D-半乳
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糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊 糖、纖維二糖、D-巖藻糖，并使終濃度為20 mg/L，觀察測(cè)定菌株是否生長(zhǎng)。 結(jié)果與討論：
XT-11菌株可以利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-木糖、 D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊糖、纖維二糖、 D-巖藻糖，其既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣。
2.2.6生理生化特征
試驗(yàn)方法：
在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，于30 °C活化培養(yǎng)24小時(shí)后，按文獻(xiàn)所述方法[2,3]，對(duì)該 培養(yǎng)物分別進(jìn)行葡萄糖氧化發(fā)酵、檸檬酸鹽利用、脲酶、卵磷脂水解、還原 硝酸鹽、產(chǎn)吲哚、甲基紅（M.R)、產(chǎn)H2S、明膠液化、七葉苷水解、厭氧生 長(zhǎng)及淀粉水解等生理生化試驗(yàn)。
結(jié)果與討論：
1)XT-11菌株的氧化酶反應(yīng)為陰性，而過(guò)氧化氫酶反應(yīng)為陽(yáng)性；不呈現(xiàn) 卵磷脂酶和脲酶活性。
2)XT-11菌不能水解淀粉、纖維素、七葉苷、酪素、明膠和油脂，但能 夠分解果膠；甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，石蕊牛奶反應(yīng)為暗紅色產(chǎn)酸；能夠由色 氨酸生成吲哚并且能夠產(chǎn)生硫化氫；硝酸鹽還原呈陰性反應(yīng)。對(duì)半乳糖、 乳糖、蔗糖和葡萄糖的氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，
3)XT-11菌對(duì)上述各種糖均屬發(fā)酵型代謝。
4)XT-11菌不能利用檸檬酸鹽，在以葡萄糖為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基 上也不能生長(zhǎng)。
2.3分泌黃原膠酶菌株的BIOLOG-GP鑒定
早在七十年代中期，一些國(guó)外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細(xì)菌
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的新方法。這些技術(shù)的應(yīng)用，為微生物檢驗(yàn)工作提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、科學(xué)的鑒 定程序，大大提高了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。目前，微生物編碼鑒定技術(shù)已經(jīng)得 到普遍應(yīng)用，并早已商品化和形成獨(dú)特的不同細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。如API、 Enterotube和BIOLOG-GP等系統(tǒng)。微生物鑒定的自動(dòng)化技術(shù)近十幾年得到了 快速發(fā)展。目前自動(dòng)化微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)已在世界范圍內(nèi)微生物分 析實(shí)驗(yàn)室中得到了廣泛應(yīng)用。
BIOLOG-GP細(xì)菌鑒定系統(tǒng)通過(guò)在一塊鑒定板上使用95種碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn) (如圖2-3)。微生物利用碳源進(jìn)行呼吸時(shí)，會(huì)將四唑類(lèi)氧化還原染色劑，從 無(wú)色還原成紫色，從而在微生物的鑒定板上形成該微生物特征性的反應(yīng)模式 或“指紋”，通過(guò)纖維光學(xué)讀取設(shè)備一讀數(shù)儀來(lái)讀取顏色變化，由于對(duì)光密 度的吸收值的差異，計(jì)算機(jī)通過(guò)概率最大模擬法，并將該反應(yīng)模式或“指紋” 與數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，將目標(biāo)微生物與數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)菌的特征數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì) 分析的微生物進(jìn)行最大限度的匹配，可以在瞬間得到鑒定結(jié)果，確定所分析 的微生物的屬名或種名[5]。利用天津市出入境檢驗(yàn)檢疫局BIOLOG 4.2細(xì)菌自 動(dòng)鑒定分析系統(tǒng)，對(duì)黃原膠降解菌株XT-11進(jìn)行了檢測(cè)。
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BiOLQG Gram Negative Identification Test Panel
GN2 MicroPlate™
A2
a-CyclodextrinA3
DextrinA4
GlycogenAS
Twe«n40AS
Twten <0N^c»ty(-0-
G«lactosamin9AS
N-Acetyl-D-
QlucosaminsA9
AdonitolA10
L-ArabinoseAll
D-ArabttolA12
D-Callobiose
i-ErythritolD-FructoseL-FUCOMD^SafsctOMOentiobios*a>0-Glucosem-lnoiitola-0-Uctos«Lactulo**BIO
MaltoseB11
D-MannitolB12
D-Mannose
Cl
D-Melibiosep-MethyU
D>Glucosld«0-PsiCOMD-Raff]noseL-Rhamnos«DiorWtolC7
Sucro$eD-Tr»halonC9
Turano««C10
XytitolC11
Pyruvic Acid Methyl EsterC12
Succinic Acid Mono-Methy<- Ester
01
Acetic
AcidD2
Cis-Aconitic
AcidD3
Citric
Acid04
Formic
AcidD-0«lactonic Acid LactoneD*G«l«cturonlc
Acid07
D-Gluconic
AcidD8
D-Olucosam)nic
AcidD9
D-Olucuronic
AcidD10
a-
Hydroxybutyrlc
AcidDll
P.
Hydroxybutyrlc
AcidD12
Hydroxybut^ic
Add
p-Hydroxy
Phcnylacetfc
Acid(laconic
Acida-Keto Butyric Acida-Keto Olutaric Acida-Kato Valeric AcidD,L-Uctie
AcidMalonic
AcidPropionic
AcidAcidE10
O-Saccharlc
AddE11
S»bacic
AcidEl 2
Succinic
Acid
Bromosuccinic
AcidSuccinamlc
AcidOlucuronamldeL-Alaninamid*D-Alanin«L-AUinlneL^lanyl-
glycineLnAsparagin*L-AtpaiticAcidF10
t-Olutamic
AcidF11
Olycyl-L-
Aspartic
AddFI 2
Olyeyl-L-
Glutamic
Acid
01
L-Htstidine02
Hydroxyl*
Proltn*03
L*L«ucin«04
L*Orn 丨 tWn«05L<Prolin*or
L^yroflluumlc
AcidOS
D>S«r{n«09
L-S»rin«010
L-Thr»〇filn«Oil
D,L-Camitln«012
y-Amino Butyric Acid
HI
Urocanic AcidH2
InotineH3
Uridin*H4
ThymidineH6
Phmyethyl-
amin«H6
PutrecclneH7
2-Amino«thanolH8
2,3-Butan«diolH9
GlycerolH10
D,U-a-Qlyc«rol
PhosphatBH11
a*D*Glucos«> 1-PhosphateH12
D-QIUCOM-
8-Phoiphate
圖2-3適用于革蘭氏陰性菌的BIOLOG板碳源
Figure 2-3 Carbon source of biolog gram negative identification test panel 培養(yǎng)基：
523培養(yǎng)基：蛋白胨8g，酵母粉4g，MgS〇4.7H2〇 0.3g，蔗糖10g，K2HPO4 2g，瓊脂 18 g, H2〇 1000mL。（pH 7.0?7.1)
試驗(yàn)方法：
稱(chēng)取特定的Biolog專(zhuān)用配套使用的BUY培養(yǎng)基75g，溶解在1250mL的蒸餾 水中，攪拌溶解10min后，加熱進(jìn)行完全溶解，放涼后分裝在三角瓶中，進(jìn)行 高壓蒸汽滅菌，溫度121°C，時(shí)間20min。
將上述兩種培養(yǎng)基，在大約36°C時(shí)倒平板。放置到27±1°C的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)48小時(shí)，以確定平板沒(méi)有被污染。然后將目標(biāo)菌液接種到532培養(yǎng)基上進(jìn) 行活化培養(yǎng)，進(jìn)行2?3次轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，時(shí)間為48小時(shí)。挑取斜面上的菌，進(jìn)行 平板劃線，采用分區(qū)劃線的形式，得到一個(gè)培養(yǎng)良好的單菌落，然后進(jìn)行培 養(yǎng)[6]，時(shí)間是48小時(shí)，溫度控制在27±1C。
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用滅菌棉簽挑取已經(jīng)培養(yǎng)好的菌落，在無(wú)菌狀態(tài)下接種到濁度管中。用 空白調(diào)至100%,用酵母菌液標(biāo)準(zhǔn)管調(diào)至47±1%。再用接種后的濁度管進(jìn)行 測(cè)量，用無(wú)菌水不斷調(diào)整濁度的大小，以達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)濁度值。
將已經(jīng)調(diào)整好濁度的菌液，用微量加樣器很仔細(xì)地接種到Biolog鑒定板 上，放置在一個(gè)大小相宜的托盤(pán)中，并保持一定的濕度，培養(yǎng)48小時(shí)。開(kāi)啟 鑒定系統(tǒng)，將已經(jīng)培養(yǎng)好的鑒定板放置到菌種鑒定儀的讀數(shù)儀上，計(jì)算機(jī)讀 取數(shù)據(jù)，按照可能性大小給出10個(gè)ID的名稱(chēng)。
結(jié)果與討論：
對(duì)結(jié)果進(jìn)行鑒定需要考慮3個(gè)參數(shù)：可能性（Probability，PRD)、相似 性(Similarity，SIM)、位距(Distance，DIS)。SIM 和 DIS 是 2 個(gè)重要的參數(shù)，
表示測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)數(shù)據(jù)的匹配程度。當(dāng)DIS<5.0，SIM>0.75為良好 的匹配；SIM值越接近于1，檢定結(jié)果的可靠性越高。
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鑒定結(jié)果如圖2-4所示，ID地址欄里沒(méi)有顯示與該菌相匹配的菌種的名 稱(chēng)。相似性最接近的 SIM 值=0.315<0.75; DIST 值=11.89>0.5。說(shuō)明 Biolog 4.2
細(xì)菌自動(dòng)鑒定分析系統(tǒng)庫(kù)中沒(méi)有與XT-11菌株類(lèi)似的菌種。
鑒定系統(tǒng)是根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中所提供的背景資料鑒定細(xì)菌，數(shù)據(jù)庫(kù)資料的不 完整將直接影響鑒定的準(zhǔn)確性。目前為止，尚無(wú)一個(gè)鑒定系統(tǒng)能包括所有的 細(xì)菌鑒定資料。對(duì)細(xì)菌的分類(lèi)是根據(jù)傳統(tǒng)的分類(lèi)方法，因此鑒定也以傳統(tǒng)的 手工鑒定方法為“金標(biāo)準(zhǔn)”。細(xì)菌的分類(lèi)系統(tǒng)隨著人們對(duì)細(xì)菌本質(zhì)認(rèn)識(shí)的加深 而不斷演變，使用自動(dòng)化鑒定儀的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)經(jīng)常與生產(chǎn)廠家聯(lián)系，及時(shí)更新 數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)自動(dòng)化鑒定儀得出的結(jié)果，必須與其它已獲得的生物性狀（如 標(biāo)本來(lái)源、菌落特征及其它的生理生化特征）進(jìn)行核對(duì)，以避免錯(cuò)誤的鑒定。
2.4分泌黃原膠酶菌株的16S rRNA基因序列測(cè)定
16S rRNA序列分析，由Carl Woese于20世紀(jì)70年代初提出的，比較研
究16S rRNA基因序列的方法，是該領(lǐng)域在方法上的革命性的突破。rRNA在 每個(gè)細(xì)胞中普遍存在，細(xì)胞的核糖體rRNA可將遺傳信息得以表達(dá)，轉(zhuǎn)譯成 蛋白質(zhì)，因此這些分子具有作為指示種系發(fā)生所必不可少的性質(zhì)。在相當(dāng)長(zhǎng) 的進(jìn)化過(guò)程中rRNA分子的功能幾乎保持恒定，而且其分子排列順序有些部 位變化非常緩慢，以致保留了古老祖先的一些序列，這就是說(shuō)，從這些排列 順序可以探測(cè)出種系發(fā)生上的親緣關(guān)系，而且rRNA在細(xì)胞中含量大，一個(gè) 典型的細(xì)菌含有10000-20000個(gè)核糖體，易于提取，可以獲得足夠的使用量， 供比較研究之用。
細(xì)菌的核糖體含有三種類(lèi)型：23S、16S、5S rRNA，它們分別含有的核 苷酸約2900、1540和120個(gè)。5S rRNA雖然易于分析，但由于核苷酸少，沒(méi)
有足夠的遺傳信息用于分類(lèi)研究。而23S rRNA含有的核苷酸幾乎是16S rRNA的兩倍，分析較困難，16S rRNA的核苷酸數(shù)量適中，最理想的研究對(duì)
象。
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試驗(yàn)儀器：
TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；
恒溫水浴箱，北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠；
電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；
PCR反應(yīng)儀，大連寶生物公司；
測(cè)序儀，ABI prismtm 377 DNA sequencer pharmacia Biotech；
凝膠成像儀：Image Master VDS FUJIFILM Thermal imaging system FTI-500 試驗(yàn)方法：
取培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基上24小時(shí)的供試菌體少量，黃原膠寡糖酶法制備及水解酶分泌菌株的定性,加入裝有200^L無(wú)菌重 蒸H2O的Eppendorf管中，旋潤(rùn)混勻后，沸水浴3 min, 12000 r/min離心5 min， 上清液作為模板DNA直接用于PCR擴(kuò)增。
用于16S rRNA的PCR反應(yīng)的引物為一對(duì)通用引物[7]。
正向弓丨物為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
反向弓丨物為：5'- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。
PCR 反應(yīng)體系(50叫)為：10xPCR 緩沖液(含 Mg2+)5pL，dNTP(5 mmol/L)1 叫，正反相引物各1叫，模板DNA1.5pL，Taq酶2.5 U，重蒸水40叫、石 錯(cuò)油30pL。
PCR 程序?yàn)椋?4 °C 5 min； 94 °C 1 min； 50 °C 1 min； 72 °C 1 min；循環(huán)
29次；72 °C 10 min。PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限責(zé)任 公司完成。
糖類(lèi)化合物與強(qiáng)無(wú)機(jī)酸混合加熱會(huì)脫水生成糖醛或其衍生物。這種物質(zhì) 能與蒽酮、苯酚等物質(zhì)縮合并顯出顏色，常用來(lái)鑒別糖類(lèi)。對(duì)羥基苯甲酸酰 肼（PAHBAH)法主要用于還原糖的測(cè)定，即分子中必需具有游離的半縮醛 羥基或具有a-羥基酮結(jié)構(gòu)[1]。
試劑及儀器：
501型超級(jí)恒溫器，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；
354 型 Multiscan Ascent 酶標(biāo)儀，芬蘭，LABSYSTEM 公司；
對(duì)羥基苯甲酸酰肼(p-Hydroxybenzoic Acid Hydrazide，PAHBAH)購(gòu)自 Sigma 實(shí)驗(yàn)方法：
PAHBAH 溶液的配制：取 0.5gPAHBAH 溶于 9.5ml 的 NaOH (5°%) PAHBAH法測(cè)定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別在水解管中加入0.5g/L的Glucose 標(biāo)準(zhǔn)溶液0pl、5pl、10^l、30pl、40pl，并用雙蒸水補(bǔ)至200pl。向上述水解 管中加入150plPAHBAH溶液，再加入600plNaOH (5%)溶液，振蕩混勻， 在120°C加熱15min，用酶標(biāo)儀在405nm下比色。
結(jié)果與討論：
用酶標(biāo)儀測(cè)定0?0.1g/L葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3-1所示，得直線方程 y=4.268x+0.149, R2=0.9973。
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圖3-1還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
Figure 3-1 The standard curve of reductive sugar 3.2黃原膠酶活力測(cè)定方法的建立
由于黃原膠溶液的粘度很大，其分子主鏈被水解則粘度下降，因此原則 上可以用底物溶液粘度下降速度來(lái)表示酶活力的大小。但是，由于黃原膠溶 液的假塑性很強(qiáng)，準(zhǔn)確測(cè)定粘度的大小對(duì)粘度計(jì)的要很高。此外，測(cè)定粘度 所需樣品的量相對(duì)較大。
因此，采用PAHBAH方法，選擇用反應(yīng)液中還原糖數(shù)量的增加速度來(lái)表 示酶活力的大小。黃原膠發(fā)酵液于9000rpm離心15min,取上清液作為酶液 按圖3-2方法檢測(cè)其活力。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將兩組OD504差值折算成 還原糖量，再根據(jù)酶活力單位的定義，算出黃原膠酶活力。
黃原膠降解酶的活力定義為每分鐘催化形成相當(dāng)于1pmol葡萄糖的還原 末端所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
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沸水浴10min (反應(yīng)組）
100|il上清酶液 ▼
沸水浴10min
I
150 [j! Xanthan Gum 溶液（0.25%〇)
100W上清酶液
150 pl Xanthan Gum 溶液（0.25%) ▼
30DC水浴反應(yīng)30min
30°C水浴反應(yīng)30min (空白組)
9000rpm 下離心 5min
取 200jl +150jl PAHBAH 溶液+600jl NAOH 溶液在 120C下加熱 15min
以蒸餾水為對(duì)照，分別測(cè)定兩組的OD405 圖3-2黃原膠酶活力的測(cè)定方法 Figure 3-2 Inspecting method of xanthan enzyme activity
3.3 XT-11的培養(yǎng)及發(fā)酵參數(shù)的確定
培養(yǎng)基：
種子培養(yǎng)基的組分為：牛肉浸膏：0.3%，酵母浸膏：0.1%，蛋白胨：0.5%， 葡萄糖：1.0%，水：98.1%，pH6.8?7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：黃原膠：0.45%,葡萄糖：0.08%,蛋白胨：0.1%, 酵母浸出粉：0.1%,水：99.27%, pH7.0左右。
黃原膠固體培養(yǎng)基的組分為：瓊脂粉：2%,蛋白胨：0.1%，酵母浸出粉:
0.1%,黃原膠：0.3%,葡萄糖：0.2%,水：97.3%。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為：黃原膠：0.45%, MgSO4: 0.05%, K2HPO4: 0.25%， NaCl: 0.1%,水：99.15%, pH7.0 左右。
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實(shí)驗(yàn)方法：
將活化后的黃原膠降解菌按1%(v/v)接種量接種至裝有100ml黃原膠 液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為 200rpm，培養(yǎng)過(guò)程中每間隔一定時(shí)間取樣，分別測(cè)定發(fā)酵液的OD620、pH值、 上清液中的還原糖含量（P-Hydroxybenzoic acid hydrazide，PAHBAH 法）及
粘度。
結(jié)果與討論：
圖3-3發(fā)酵液參數(shù)的變化 Figure 3-3 Fermentation diagram 將黃原膠降解菌XT-11接種于黃原膠液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測(cè)定培養(yǎng)過(guò) 程中的細(xì)胞濃度、還原糖含量和粘度的變化，結(jié)果如圖3-3所示。由于發(fā)酵 液的配比中加入了少量的葡萄糖加快了菌株的最初生長(zhǎng)速度，當(dāng)有還原糖(葡 萄糖）存在時(shí)發(fā)酵液的粘度沒(méi)有下降，說(shuō)明沒(méi)有降解酶的出現(xiàn)。發(fā)酵一天后， 發(fā)酵液中的葡萄糖耗盡，該菌株開(kāi)始分泌降解酶降解黃原膠（現(xiàn)象反映為還 原糖的生成以及發(fā)酵液表觀粘度的下降），有明顯的二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，可斷定 該酶為底物誘導(dǎo)型酶。此外，發(fā)酵液中還原糖的大量生成滯后于發(fā)酵液粘度
41
的大幅降低，說(shuō)明最先起降解作用的是主鏈降解酶（xanthase)，伴隨著還原 糖量持續(xù)升高則說(shuō)明了發(fā)酵液中側(cè)鏈降解酶（xanthan lyase)的存在。而發(fā)酵 液的pH值在發(fā)酵過(guò)程中基本保持不變，只是在發(fā)酵后期略有上升。
3.4發(fā)酵條件的優(yōu)化
微生物產(chǎn)酶是個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，不同的培養(yǎng)條件直接影響菌體的 代謝，從而影響酶的產(chǎn)量，因此，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化是提高產(chǎn)酶量的 前提。
試劑與儀器：
AEG-120電子分析天平，日本，島津公司；
7901型磁力攪拌器，上海華光儀器儀表廠；
4330型pH計(jì)，英國(guó)，JENWAY公司；
對(duì)羥基苯甲酸酰肼（PAHBAH)購(gòu)自Sigma，USA;
其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/div>
42
首先考察了氮源物質(zhì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%的7 種不同種類(lèi)的氮源，培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)定菌體生物量及酶活（見(jiàn)表3-1)。 從表3-1中可以看出，硝酸銨發(fā)酵水平較高，而且來(lái)源容易，因此選其作為 發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源物質(zhì)。
表3-1氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響
Table 3-1 Effects of nitrogen sources on the bacterium growth and xanthase production
氮源生物量（OD620)酶活 / IU.L-1
酪蛋白0.39760
蛋白胨0.333104
尿素0.32422
硝酸銨0.452338
硫酸銨0.42161
硝酸鈉0.33855
氯化銨0.33628
3.4.2碳源對(duì)發(fā)酵的影響：
向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%的硝酸銨及1%不同種類(lèi)的碳源，培養(yǎng)72小時(shí)
后，測(cè)菌體生物量及酶活，表3-2表明，葡萄糖效果最好。
表3-2碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響
Table 3-2 Effects of carbon sources on the bacterium growth and xanthase production
碳源生物量（OD620)酶活 / IU.L-1
葡萄糖0.572444
蔗糖0.33387
D-木糖0.347217
乳糖0.452188
異麥芽糖0.247112
海藻酸鈉0.511319
阿拉伯膠0.3380
D-果糖0.499282
D-甘露糖0.32952
棉子糖0.422245
43
OS ao / SSBE0!g _鬆別
值
用HCl和NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH,滅菌后用同一制備的菌懸液接 種，考察了上述優(yōu)化確定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別為6、6.5、7、7.5和8 時(shí)發(fā)酵液的黃原膠酶活性及菌體密度，結(jié)果顯示（圖3-5)初始pH 7.0時(shí)發(fā) 酵液產(chǎn)生的黃原膠酶活性最高，菌體密度也達(dá)到最大，因此發(fā)酵過(guò)程應(yīng)該在 中性條件下進(jìn)行。
圖3-5 pH對(duì)菌體生長(zhǎng)及廣酶的影響
Figure 3-5 The effects of pH on the growth and enzyme production
3.4.4通氣量對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：
在250mL三角瓶中分別加入不同體積的培養(yǎng)基，各接1°%種子液，在 30°C，pH 7.0, 200 r/min培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)定各發(fā)酵液的酶活及菌體密度。
結(jié)果顯示（圖3-6),搖瓶裝液量為30mL時(shí)其發(fā)酵液的酶活以及菌體生物量 達(dá)到最高，因此可以確定最佳搖瓶裝液量為30mL。
44
5/芻0«{SO寸ao)鵲幽設(shè)
3.4.5溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)黃原膠酶的影響：
分別考察了 25°C、30°C、35°C培養(yǎng)溫度下發(fā)酵液黃原膠酶活力隨時(shí)間的 變化規(guī)律，其他發(fā)酵條件為：搖瓶裝量為30mL,初始pH為7.0,接種量為1%， 搖速為200 r/min。結(jié)果可知（圖3-7)在發(fā)酵溫度為30C時(shí)酶活最高。
3.4.6溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響：
分別考察了 25C、30C、35C培養(yǎng)溫度下發(fā)酵液菌體密度隨時(shí)間的變化 規(guī)律，其他發(fā)酵條件為：搖瓶裝量為30mL,初始pH為7.0,接種量為1%, 搖速為200 r/min。結(jié)果可知（圖3-8)在發(fā)酵溫度為30C時(shí)可獲得最大菌體
量。
3.4.7底物濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)黃原膠酶的影響：
考察了底物濃度分別為0.5%、1%、1.5%時(shí)發(fā)酵液黃原膠酶活力隨時(shí)間 的變化規(guī)律，其他發(fā)酵條件為：搖瓶裝量為30mL,初始pH為7.0,接種量 為1%,搖速為200 r/min。結(jié)果可知（圖3-9)在底物濃度為1%時(shí)酶活最高。
45
3.4.8底物濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響：
考察了底物濃度分別為0.5%、1%、1.5%時(shí)發(fā)酵液菌體生長(zhǎng)隨時(shí)間的變 化規(guī)律，其他發(fā)酵條件為：搖瓶裝量為30mL，初始pH為7.0,接種量為1%， 搖速為200 r/min。結(jié)果可知（圖3-10)在底物濃度為1%時(shí)菌體生長(zhǎng)量最高。
圖3-8溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響
圖3-10底物濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響
Figure 3-9 The effects of concentration of xanthan on the growth Figure 3-10 The effects of concentration of xanthan
on the enzyme production
46
3.4.9種齡及接種量對(duì)發(fā)酵的影響：
按不同接種量將不同種齡的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，16?24h的種 子產(chǎn)酶較高，而接種量的影響不大。
3.4.10菌株XT-11產(chǎn)黃原膠酶的正交試驗(yàn)：
根據(jù)搖瓶中單因子試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)確定XT-11 發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件。根據(jù)正交試驗(yàn)分析(如表3-3)，XT-11菌株產(chǎn)酶的最佳 條件是：培養(yǎng)溫度30°C，起始pH為7,底物濃度為1%。其中影響最大的是 生長(zhǎng)溫度，其次是底物濃度與裝瓶量，pH影響最小。
表3-3正交試驗(yàn)結(jié)果
Table 3-3 Result of orthorhombic testing
實(shí)驗(yàn)組溫度（°c)pH裝量（mL)底物濃度酶活力（U/mL)
1256300.50%0.3145
2257501%0.4227
3258751.50%0.4578
4306751%0.5031
5307301.50%0.4557
6308500.50%0.3698
7356501.50%0.301
8357750.50%0.3145
9358301%0.2944
Ki1.221.151.091.03--
K21.331.191.091.22--
K30.911.121.281.21--
R0.420.070.190.19--
3.5黃原膠寡糖的制備
多聚糖降解制備寡糖的方法主要有三種，即化學(xué)降解法[2]、物理降解法[3] 和生物酶降解法[4]。化學(xué)法由于不易控制，降解產(chǎn)物為價(jià)值不大的單糖，得 不到所需的低分子量寡糖，且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，已逐漸被淘汰。物理降解法
47
主要是利用電磁輻射使糖苷健斷裂而產(chǎn)生低聚糖，它需要有一套具有高輻射 強(qiáng)度的電離輻射設(shè)備和相應(yīng)的防護(hù)設(shè)施，目前僅處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，實(shí)際 應(yīng)用具有一定的局限性。酶降解法具有反應(yīng)條件溫和，寡糖得率高，不造成 環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。它不僅可以獲得低聚寡糖，而且容易控制寡糖的聚合度， 是低聚糖制備的方向。
試劑與儀器：
對(duì)羥基苯甲酸酰肼（PAHBAH)購(gòu)自Sigma，USA;
其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/div>
4330型pH計(jì)，英國(guó)，JENWAY公司；
GL-21M高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)廠；
QHZ-98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠；
BIOSTAT發(fā)酵罐，德國(guó)，Heidolph公司
實(shí)驗(yàn)方法：
將培養(yǎng)3?4天的發(fā)酵液（以培養(yǎng)液的粘度大幅度降低為根據(jù))在9000rpm， 4°C條件下離心15分鐘以除去菌體，留上清液備用。黃原膠溶于磷酸鹽緩沖 液（60mmol/L，pH=5.9)中配成2°%Xanthan Gum溶液。將上清液作為粗酶 液與2°%Xanthan Gum溶液于30C恒溫?fù)u床中保溫酶解。選取不同的時(shí)間終 止酶解反應(yīng)，測(cè)溶液粘度、生物量、還原糖三項(xiàng)指標(biāo)。在9000rpm，4C條件 下離心15分鐘以除去菌體，用Sevag法除去蛋白[5]，經(jīng)乙醇洗滌后濃縮凍干 可得粗寡糖。
48
結(jié)果與討論:
為了確保降解充分，首先選取粗酶液與底物濃度5: 1的比例進(jìn)行反應(yīng)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3-11) , 24小時(shí)底物粘度下降98%，同時(shí)還原糖含量達(dá)到最高， 而菌體密度在降解的過(guò)程中隨時(shí)間的推移不斷的增長(zhǎng)。
圖3-11黃原膠降解參數(shù)曲線I Figure 3-11 Diagram curve of xanthan degrading I
在對(duì)第一次酶解參數(shù)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，對(duì)粗酶液與底物濃度的配比進(jìn) 行了調(diào)整，降低到了 1 1進(jìn)行第二次酶解分析。第二次酶解結(jié)果（如圖3-12) 顯示出了與第一次相類(lèi)似的特性。42小時(shí)底物粘度下降99%以上，同時(shí)還原 糖含量達(dá)到高峰，菌體密度隨著酶解的進(jìn)行不斷增長(zhǎng)?？梢?jiàn)，在第二次酶解 條件下，雖然酶解時(shí)間增長(zhǎng)了近一倍，但卻大大節(jié)省了酶液的用量，因此這 個(gè)條件更有利于黃原膠寡糖的制備。
49
圖3-12黃原膠降解參數(shù)曲線II Figure 3-12 Diagram curve of xanthan degradingH
3.6本章小結(jié)
本章對(duì)影響鞘氨醇單胞菌XT-11菌株產(chǎn)黃原膠酶的主要因子進(jìn)行了研 究，篩選出有利產(chǎn)酶的各實(shí)驗(yàn)因子的適宜水平。結(jié)果表明，酶形成的適宜溫 度為30°C，培養(yǎng)基適宜起始pH值為7.0，培養(yǎng)基適宜底物濃度為1°%，搖瓶 發(fā)酵用250mL三角瓶裝液30mL酶活力較高。適宜種齡為16?24h,接種量 對(duì)發(fā)酵影響不大。通過(guò)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定了溫度對(duì)于菌株XT-11 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響最大，裝瓶量與底物濃度的影響次之，pH值影響最小。同時(shí) 也對(duì)黃原膠酶法降解的工藝條件進(jìn)行了初步的探究，確定了粗酶液與底物溶 液濃度比為1: 1的條件更有利于黃原膠寡糖的制備。
在生物體生命活動(dòng)的氧化代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生各種自由基。自由基不僅 是生物體多種生理功能的啟動(dòng)因素和生化反應(yīng)的介導(dǎo)者，同時(shí)也在免疫細(xì)胞 因子網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)也會(huì)產(chǎn)生各種活性氧自由基，但正常情況下機(jī)體各 種抗氧化酶或抗氧化劑能維持活性氧代謝的平衡。一旦這種平衡打破，造成 體內(nèi)活性氧積聚，即可引起機(jī)體病變。人類(lèi)的多種疾病，包括腫瘤、心腦血管 病、糖尿病、老年癡呆癥以及衰老等都與活性氧自由基有關(guān)[1]。
因此，具有清除自由基效能的某些外源性抗氧化劑如抗壞血酸、維生素 E、胡蘿卜素類(lèi)和多酚類(lèi)等化合物受到重視[2]。近代醫(yī)學(xué)研究成果表明，生物 活性多糖也具有較強(qiáng)的抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)鼠尾藻多糖、褐藻多糖、黃原 膠及其衍生物、甲殼質(zhì)及其衍生物[3]都具有較好的清除自由基活性或體內(nèi)抗 氧化活性。黃原膠在食品、醫(yī)藥衛(wèi)生等方面有廣泛的應(yīng)用。但由于其凝性強(qiáng)， 不易被吸收，黃原膠寡糖酶法制備及水解酶分泌菌株的定性,在應(yīng)用方面受到很大的限制。而黃原膠經(jīng)酶降解成為寡糖后， 水溶性好，有利于人體吸收，黃原膠寡糖的研究將會(huì)成為新的熱點(diǎn)。
4.1.1黃原膠寡糖清除DPPH自由基活性
1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH*)是一種穩(wěn)定的自由基，在有機(jī)溶劑（如 乙醇、甲醇）中呈紫色，在517nm處有強(qiáng)吸收。加入抗氧化劑后，一部分自 由基被清除，使吸收減弱，可借此來(lái)評(píng)價(jià)該物質(zhì)的抗氧化活性，并已成為鑒 定一種化合物是否有此活性的經(jīng)典方法[4]。
52
實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：
DPPH •，Sigma 公司；維生素 E，Sigma 公司；BHT，Sigma 公司；Trolox, Sigma公司；乙醇，市售分析純；6505紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)。
實(shí)驗(yàn)方法：
(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制
I將DPPH •溶于乙醇中，配制200pmol/LDPPH •溶液。
II 將 a-tocophero 溶于乙醇中，配制 0pmol/L，12.5pmol/L，25pmol/L， 50pmol/L，100pmol/L 的 a-tocophero 溶液。
III將DPPH •溶液與a-tocophero溶液在水解管中等體積混合，向反應(yīng)體系 中通入氮?dú)庵脫Q出其中的空氣，立即旋緊蓋子。
IV避光反應(yīng)60min后測(cè)定反應(yīng)液的OD517。
(2)黃原膠寡糖清除DPPH •作用的測(cè)定
將要測(cè)定的試樣換為不同濃度的黃原膠寡糖，其余步驟同上。
(3)不同抗氧化劑對(duì)DPPH •清除的比較
以 BHT、Trolox、a-tocopherol 作為參照，根據(jù) Alexandre C 和 Takashi Y 等人的研究，并進(jìn)行設(shè)計(jì)改良，用DPPH法測(cè)定分析比較了其抗氧化活性。
具體方法是：2ml抗氧化劑溶液中加入2X10-4mmol/L的DPPH無(wú)水乙 醇溶液2ml，搖勻，于517nm處測(cè)定其吸光度，每5min測(cè)一次，直至吸光 度的變化在1°%以?xún)?nèi)。其中BHT、a-tocopherol為0.1mg/mL無(wú)水乙醇溶液； Trolox為0.1mg/ml水溶液；黃原膠寡糖為2mg/mL水溶液。
結(jié)果及討論：
DPPH•清除效率的計(jì)算：
DPPH •清除效率=[A0-(A1-A2)]*100%/A
其中，Ac:DPPH •溶液+有機(jī)溶劑的吸光度；A1:DPPH* +抗氧化劑
溶液的吸光度；A2:有機(jī)溶劑+抗氧化劑溶液的吸光度。
53
a-tocopherol (umol/L)
圖4-1 a- tocopherol清除DPPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Figure 4-1 DPPH scavenging activity of a-tocopherol
糖對(duì)DPPH •的清除效率
(％)賺涯«£da
54
圖4-2黃原膠寡糖清除DPPH結(jié)果 Figure 4-2 DPPH scavenging activity of oligoxanthan
(1)陽(yáng)性對(duì)照a-tocopherol對(duì)DPPH •清除效率標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
圖4-3不同抗氧化劑抗氧化活性的比較（DPPH法）
Figure 4-3 The scavenging effect of antioxidants on DPPH •
小結(jié)：
I .黃原膠的降解產(chǎn)物（Oligoxanthan)有較強(qiáng)的抗氧化活性，且隨著濃度的 增加，酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的活性增大。當(dāng)濃度為2000ppm時(shí)，清除 DPPH的效率即達(dá)到了 70°%，相當(dāng)于40pmol/L陽(yáng)性對(duì)照a-tocopherol的清除
效率。
II.從黃原膠寡糖、BHT、Trolox和a-tocopherol在DPPH體系中的抗氧化 動(dòng)態(tài)變化中(如圖7)，可以看出，Trolox和a-tocopherol能快速清除自由基， 10min后，表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的抗氧化活性；BHT稍慢一些，但也明顯快于黃 原膠寡糖，黃原膠寡糖80min后才基本趨于穩(wěn)定。這也說(shuō)明該寡糖是一種長(zhǎng) 效的抗氧化劑。各物質(zhì)的最終抗氧化活性順序?yàn)椋篢rolox > a-tocopherol > BHT >黃原膠寡糖。
55
羥自由基（*〇H)被認(rèn)為是體內(nèi)最活躍的活性氧自由基，輻射損傷等物 理、化學(xué)因子都會(huì)促進(jìn)其形成，是造成生物有機(jī)體過(guò)氧化損傷的主要因素。 羥基自由基可介導(dǎo)許多病理變化，如引發(fā)不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng), 并損傷生物膜的功能和結(jié)構(gòu)，因此羥基自由基的清除對(duì)于生物體具有重要意 義。
實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：
維生素E, Sigma公司；水楊酸，Sigma公司；H2O2及FeS〇4，國(guó)產(chǎn)分
析純；乙醇，市售分析純；6505紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)。
實(shí)驗(yàn)方法：
H2O2和Fe2 +混合發(fā)生:Fenton反應(yīng)，生成具有很高反應(yīng)活性的• OH， 其能被水楊酸有效的捕捉，并生成有色物質(zhì)；但若加入具有清除作用的物質(zhì)， 便會(huì)與水酸競(jìng)爭(zhēng)，從而使有色產(chǎn)物生成量減少。
本實(shí)驗(yàn)以Smironff等[5]的方法為基礎(chǔ)并改進(jìn)。反應(yīng)體系中含8.8mmol/L H2O21ml，9 mmol/L FeSO41ml，9 mmol/L 水楊酸-乙醇 1ml，不同濃度的寡 糖溶液1ml。最后加H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37°C反應(yīng)0.5小時(shí)，以蒸餾水為參比， 在510nm下測(cè)各濃度的吸光度?？疾旃烟潜旧淼奈庵?，以9 mmol/L FeSO41ml、9 mmol/L水楊酸-乙醇1ml、不同濃度的寡糖溶液1ml與1ml蒸 餾水為寡糖的本底吸收。
結(jié)果與討論：
羥自由基（• OH)是最活潑也最具危害性的自由基，往往也更難清除， 已發(fā)現(xiàn)許多抗氧化物質(zhì)能清除其它活性氧但卻不能清除• OH自由基。由表 4-1可知，添加黃原膠寡糖各實(shí)驗(yàn)組的OD510值低于對(duì)照組，表明黃原膠寡 糖具有一定的清除*OH的作用，且隨著濃度的增加，其清除*OH的效果 亦增加。
56
Table 4-1 The scavenging effect of Oligo XG on • OH
黃原膠寡糖濃度(昭/ml)OD510清除率(°%)
500.079±0.0019.3
1000.076±0.00111.6
1500.075±0.00112.8
2500.068±0.00120.5
100(VE)0.042±0.00251.2
對(duì)照組0.086±0.001--
0 L
50ppm 100ppm 150ppm 250ppm 100ppm
圖4-4黃原膠寡糖清除• OH的效果 Figure 4-4 The scavenging effect of Oligo XG on • OH
4.1.3黃原膠寡糖清除超氧自由基（O2-*)活性
超氧陰離子（Of)在機(jī)體代謝過(guò)程中是生物體內(nèi)最早產(chǎn)生的一種活性 氧自由基。在氧分子接受電子還原為水的過(guò)程中首先產(chǎn)生的是超氧陰離子自 由基或其質(zhì)子化產(chǎn)物。如果能在此階段將其猝滅，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，無(wú)疑 具有十分重要的意義。
實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：
鄰苯三酚，國(guó)產(chǎn)分析純；
鹽酸，市售分析純；
57
壬
o o
4 2
(％)條盤(pán)鵝
壬
士
6505紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)，美國(guó)，JENWAY公司 實(shí)驗(yàn)方法：
鄰苯三酚在弱堿性介質(zhì)中會(huì)自身氧化分解產(chǎn)生O2_ •，利用O2_ •清除劑能 使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在325nm處的吸收峰受到抑制這一特點(diǎn)，進(jìn)行光化學(xué) 方法測(cè)定。
取 4.5ml 50mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液（pH8.2)，4.2ml 蒸餾水，混勻后 在25°C水浴中保溫20min，取出后立即加入在25°C預(yù)熱過(guò)的3mmol/L鄰苯三 酚0.3ml(以10mmol/LHCl配制，空白管用10mmol/LHCl代替鄰苯三酚的HCl
溶液)。迅速搖勻后倒入比色杯，325nm下每隔30s測(cè)吸光度計(jì)算線形范圍內(nèi) 每分鐘吸光度的增加。加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的寡糖溶液，蒸餾 水作對(duì)照，然后按下述方法計(jì)算：
抑制率（％) = (AA0-AA) /AA。X 100 AA0為鄰苯三酚自氧化速率 AA為加入寡糖溶液后鄰苯三酚的自氧化速率 結(jié)果與討論：
表4-2結(jié)果顯示：在鄰苯三酚自氧化化學(xué)發(fā)光體系中不同濃度的Oligo XG均能有效的清除O2-•，且隨濃度升高，清除率也逐漸提高，存在劑量依賴(lài) 關(guān)系。相對(duì)而言其清除活性與維生素E (VE)接近。
表4-2 Oligo XG在鄰苯三酚自氧化化學(xué)發(fā)光體系中對(duì)O2- •的清除
Table 4-2 Scavenging effects of Oligo XG on O2- • in 1,2,3-benzentriol auto-oxidation system
實(shí)驗(yàn)組（昭/ml)超氧陰離子自由基生成量（OD 325/3 min)清除率（°%)
00.374±0.0025—
500.265±0.002124.8
1000.215±0.001839.1
2000.170±0.002850.4
4000.131±0.001763.9
100(VE)0.211±0.001544.8
58
4.1.4黃原膠寡糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的作用
H2O2也是機(jī)體中一種重要的活性氧，在脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)中往往起著 啟動(dòng)的作用。臨床已發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞膜的氧化損傷是溶血的重要原因。H2O2造 成紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，膜的流動(dòng)性下降，通透性增加，從而造成膜內(nèi)外物 質(zhì)的內(nèi)瀉和外流，膜形成“小孔”，細(xì)胞內(nèi)K+丟失而溶血。
實(shí)驗(yàn)方法：
取新鮮抗凝血，用〇.9°%NaCl溶液清洗、離心，至上清液無(wú)色。紅細(xì)胞 (RBC)配成1°%的懸液，各試管分別加入1ml該懸液和不同濃度的寡糖溶 液，混勻。加入1500的0.5mol/L H2O2，生理鹽水補(bǔ)充至1.5ml,寡糖濃度 分別為 0pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml, 37°C溫 浴1小時(shí)，離心取上清，測(cè)540nm光吸收值。
結(jié)果與討論：
由表4-3所示，H2O2可以氧化紅細(xì)胞膜，導(dǎo)致血紅蛋白逸出，從而使其 吸光值的增加，黃原膠寡糖各劑量組均可抑制這種作用。一定劑量的黃原膠 寡糖可以顯著降低小鼠紅細(xì)胞的溶血度。經(jīng)T檢驗(yàn)表明，各劑量組與對(duì)照組
59
相比均有極顯著性差異(p<0.01)，隨著寡糖濃度的升高，其清除作用也逐漸 加強(qiáng)，呈現(xiàn)量效關(guān)系，在較低的濃度水平(100^g/ml)，即有很強(qiáng)的抑制作用。 表4-3黃原膠寡糖對(duì)氏〇2誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞溶血的影響
Table 4-3 Effect of Oligo XG on RBC Hemolysis Induced by H2O2
試驗(yàn)組黃原膠寡糖 濃度（昭/ml)OD405溶血度
(%)抑制率 ( %)
對(duì)照組(VE)500.1765±0.002569.7430.27
H2O2誘導(dǎo)組00.2531±0.0013--
H2O2 誘導(dǎo)組+Oligo XG500.2302±0.006190.959.11
H2O2 誘導(dǎo)組+Oligo XG1000.1942±0.005176.7323.34
H2O2 誘導(dǎo)組+Oligo XG2000.1413±0.003455.8344.31
H2O2 誘導(dǎo)組+Oligo XG4000.1122±0.005444.3355.82
圖4-6黃原膠寡糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的作用 Figure 4-6 The effect of Oligo XG on RBC hemolysis induced by H2O2
60
4.2黃原膠寡糖對(duì)皮膚淺部真菌的抑制作用的研究
淺部真菌感染是臨床常見(jiàn)病，局部常伴有明顯的炎癥反應(yīng)，還可繼發(fā)細(xì) 菌感染。其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率日益受到醫(yī)患雙方的重視。中醫(yī)辨證治療本 病積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，黃原膠寡糖酶法制備及水解酶分泌菌株的定性,方法多樣，療效肯定，但亦存在湯藥劑型不便等不足。 因此有必要探索與尋求療效顯著、作用廣譜、副作用小、應(yīng)用簡(jiǎn)便、價(jià)格低 廉的天然產(chǎn)物藥制劑[6]。
寡糖作為一類(lèi)天然的活性物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)方面被認(rèn)為是植物病害的有效抑 制劑，對(duì)多種植物病原真菌有抑制作用。然而，它對(duì)于非植物來(lái)源致病真菌 的抑制作用至今尚無(wú)報(bào)道。
本節(jié)是對(duì)黃原膠寡糖抑制皮膚淺表致病真菌的首次報(bào)道。
供試病原菌：
取常見(jiàn)淺表皮膚致病性真菌臨床分離株，共5種（如圖4-7):紅色毛癬 菌 ^Trichophyton rubrum)、石骨樣小抱子菌（Micmsporum gypseum)、犬小 抱子菌（Micmsporum)、抱子絲菌（)、白色念珠菌（ albicans)
以上菌株由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科真菌室提供。
61
A:紅色毛癬菌；B:白色念珠菌；C:石膏樣小孢子菌；D:孢子絲菌 培養(yǎng)基：
沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。（中國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)技術(shù)研究所北京路橋技 術(shù)有限公司）由1%蛋白胨和2%葡萄糖等組成，pH值為7.0。
實(shí)驗(yàn)方法：
本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的固體培養(yǎng)基加藥法[7]。
(1)制備菌懸液：
將受試菌種連續(xù)2次轉(zhuǎn)種至新鮮沙氏培養(yǎng)基以保證純度和活力，無(wú)菌吸 管吸取2-3mL無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔，混勻、過(guò)濾、稀釋?zhuān)苽涑删鷳乙海?用比濁法矯正濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬ㄔ摑岫认喈?dāng)于1X105?SXlO^fu.L-1)，試 驗(yàn)前接種菌量，用定量吸管吸取鋪種沙氏平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
(2)培養(yǎng)基的制備：
稱(chēng)取5g寡糖，用水溶液定容至100mL，配制成5°%寡糖作為原液將其進(jìn) 行對(duì)比稀釋?zhuān)倥c沙氏培養(yǎng)基混勻，使培養(yǎng)基中寡糖濃度分別為625、1250、 2500、5000、10000、20000mg.L-1。
(3)接種與培養(yǎng)：
取0.1mL菌液接種于藥物平皿上，置25?28°C培養(yǎng)，于第7、14天觀察 有無(wú)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)。
(4)判定結(jié)果：
每天記錄觀察結(jié)果，以無(wú)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的最高藥物稀釋倍數(shù)為該藥的MIC (最低抑菌濃度）。
62
(1)黃原膠寡糖對(duì)皮膚淺表致病菌的抑制作用
培養(yǎng)14天后，犬小孢子菌、紅色毛癬菌及石膏樣小孢子菌在10000mg.L-1 稀釋濃度始有生長(zhǎng)，其最低抑菌稀釋度為5000mg.L-1。孢子絲菌在5000mg.L-1 稀釋濃度始有生長(zhǎng)，其最低抑菌稀釋度為2500 mg.L-1。而白色念珠菌則在 10000mg.L-1稀釋濃度始有生長(zhǎng)，其最低抑菌稀釋度為5000 mg.L-1 (見(jiàn)表 4-4)。
挑選最低抑菌稀釋度下未生長(zhǎng)的菌塊，重新接種于不含寡糖的沙氏培養(yǎng) 基上，25?28°C培養(yǎng)觀察14天。結(jié)果除白色念珠菌外其他4種皮膚淺表真菌 均未見(jiàn)生長(zhǎng)說(shuō)明黃原膠寡糖濃度對(duì)淺部真菌不僅具有抑制作用而且有殺滅作
用。
表4-4黃原膠寡糖抑菌試驗(yàn)結(jié)果 Table 4-4 Anti-dermatophytic effect of oligoxanthan
藥物濃度 (mg/L)犬小孢子菌孢子絲菌紅色毛癬菌石膏樣小孢子菌白色念珠菌
20000-----
10000----+
5000+-+++
2500+++++
1250+++++
625+++++
陽(yáng)性對(duì)照+++++
注：（+)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)；（-)試驗(yàn)菌未生長(zhǎng)
(2)殼寡糖對(duì)皮膚淺表致病菌的抑制作用
培養(yǎng)14天后，犬小孢子菌與孢子絲菌在5000mg.L-1以上的稀釋度始有生 長(zhǎng)，其最低抑菌稀釋度為2500 mg.L-1;而紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌以及 白色念珠菌則在10000m g.L-1以上有生長(zhǎng)，最低抑菌稀釋度為5000mg.L-1(見(jiàn) 表 4-5)。
63
挑選最低抑菌稀釋度下未生長(zhǎng)的菌塊，重新接種于不含寡糖的沙氏培養(yǎng) 基上，25?28°C培養(yǎng)觀察14天。結(jié)果除白色念珠菌外其他4種皮膚淺表真菌 均未見(jiàn)生長(zhǎng)說(shuō)明殼寡糖濃度對(duì)淺部真菌不僅具有抑制作用而且有殺滅作用。
表4-5殼寡糖抑菌試驗(yàn)結(jié)果
Table 4-5 Anti-dermatophytic effect of chitooligosaccharide
注：（+)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)；（-)試驗(yàn)菌未生長(zhǎng)
藥物濃度 (mg/L)犬小孢子菌孢子絲菌紅色毛癬菌石膏樣小孢子菌白色念珠菌
20000-----
10000-----
5000--+++
2500+++++
1250+++++
625+++++
陽(yáng)性對(duì)照+++++
4.3黃原膠寡糖對(duì)ACE抑制活性的研究
腎素一血管緊張素系統(tǒng)是調(diào)節(jié)人體血壓和血容量的主要機(jī)制之一。腎素
(血管緊張肽原酶）通過(guò)血液進(jìn)入肝臟刺激血管緊張素原釋放一種非活性10
肽，血管緊張素I。在血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶（ACE)的作用下，通過(guò)脫去C端
His-Leu二肽，由血管緊張素I轉(zhuǎn)化為有生物活性的血管緊張素II。血管緊
張素II是已知最強(qiáng)的收縮血管的物質(zhì)之一，具有收縮小動(dòng)脈，興奮交感神經(jīng)，
刺激腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮，從而產(chǎn)生強(qiáng)升壓作用[8,9]。因此，抑制ACE的
活性，減少血管緊張素II的生物合成，就能起到降低血壓的效果。目前臨床
上使用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類(lèi)的降壓藥就是利用這種機(jī)理發(fā)揮作用的 [10-12]
〇
食物中有許多ACE抑制活性的化合物，它們大都來(lái)源于大豆蛋白、酪蛋 白、玉米蛋白、膠原蛋白及其他蛋白如魚(yú)類(lèi)蛋白等[13]。然而不僅自然界廣泛 存在的蛋白降解肽具有ACE抑制活性，許多寡糖類(lèi)物質(zhì)也具有這種生物活
64
性。醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證明高血壓和血液中cr含量密切相關(guān)。作為自然界唯一帶 正電荷的堿性寡糖，殼寡糖能與cr結(jié)合，降低血液中cr的含量，使血管緊 張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)活性降低，血管緊張素II形成減少，體內(nèi)緩激肽增加， 血管擴(kuò)張，起到降血壓作用。
實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：
ACE和馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hip-His-Leu):美國(guó)Sigma公司；甲醇為 色譜純；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。色譜柱：pEliteTM C18 P/N 1522737 ( 4.6 mm i. d. x 250 mm)(大連依利特分析儀器有限公司）；檢測(cè)器：UV230+紫外 -可見(jiàn)檢測(cè)器（大連依利特分析儀器有限公司）；液相色譜泵：P230高壓恒流 泵（大連依利特分析儀器有限公司）；工作站：EC2000 (大連依利特分析儀 器有限公司）；酸度計(jì)：4330 Conductivity & pH Meter (美國(guó)JENWAY公司)。 實(shí)驗(yàn)方法：
流動(dòng)相的配制：300ml甲醇加0.5ml冰醋酸和1ml三氟乙酸，用蒸餾水 定容至1000ml,再用固體NaOH調(diào)節(jié)pH至3.30。
采用反相高壓液相色譜（RP-HPLC)定量ACE與三肽底物Hip-His-Leu 反應(yīng)生成馬尿酸。樣品溶于超純水中，離心（7200xg，15min),保留上清液。 取樣品 5pL 和 ACE (0.25U 溶于 2.5mL0.1mol/L、pH8.3、含 0.5mol/LNaCl 的硼酸緩沖液)15^L于37°C保溫5min，加入25^L6.5mmol/L底物37°C反應(yīng) 30min，加入5pl1mol/L的TFA (三氟乙酸）溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫，取 10pl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)樣，通過(guò)HPLC洗脫圖譜定量馬尿酸的生成量，判斷樣品的 ACE抑制活性。
抑制率(％)=(對(duì)照馬尿酸峰值-樣品的馬尿酸峰值)/對(duì)照的馬尿酸峰值 x100%
65
圖4-8所示，HPLC洗脫圖譜中的吸收峰1?3分別代表了對(duì)照馬尿酸峰 值、黃原膠寡糖馬尿酸峰值以及殼寡糖馬尿酸峰值。根據(jù)公式計(jì)算出黃原膠 寡糖對(duì)ACE的抑制率為12.4°%，而殼寡糖對(duì)ACE的抑制率為24.6°%。
4.4黃原膠寡糖誘抗生物活性的探索
66
植物體內(nèi)存在潛在抗病性，受到外界損害和病原物侵染的植物可通過(guò)激 發(fā)子和誘導(dǎo)劑（inducer)激活植物抗病基因，使植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，以免 受到進(jìn)一步的傷害，這一現(xiàn)象已在許多研究中得到證實(shí)。其中，寡聚糖作為 一種新型生物誘抗劑已在許多作物上得到應(yīng)用，越來(lái)越受到人們廣泛關(guān)注。 寡聚糖種類(lèi)很多，目前常見(jiàn)的有葡聚寡糖、寡聚半乳糖醛酸、幾丁質(zhì)寡糖和 殼寡糖等可激活植物的防衛(wèi)系統(tǒng)，提高植物自身免疫力[14]。
活性寡聚糖是一類(lèi)由3?10個(gè)單糖組成，具有一定結(jié)構(gòu)和生物活性的聚合 體，國(guó)際上研究較多的是植物及微生物細(xì)胞壁多糖降解的寡糖片斷。越來(lái)越 多的試驗(yàn)結(jié)果表明，植物細(xì)胞壁不僅起到防御的結(jié)構(gòu)屏障作用，而且受到病 菌感染時(shí)能起到積極防御反應(yīng)。一方面，植物細(xì)胞壁酶水解病原菌細(xì)胞壁中 的P-肽葡聚糖幾丁質(zhì)等，產(chǎn)生活性成分，誘導(dǎo)植物植保素等合成酶系基因表 達(dá)；另一方面，病菌入侵植物時(shí)，必須水解植物細(xì)胞壁的多糖，其降解產(chǎn)物 也能誘導(dǎo)植保素合成。因此，寡聚糖可有效地誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，激活 植物的系統(tǒng)性獲得免疫反應(yīng)。
根據(jù)這一理論，由十字花科植物致病菌野油菜黃單孢菌分泌的黃原膠的 寡糖碎片很可能擁有植物的誘抗活性。
實(shí)驗(yàn)方法：
大豆子葉法（Soybean Cotyledon Bioassay) [15]:
豆科植物在受到病原體侵染時(shí)，能通過(guò)莽草酸途徑、醋酸-丙二酸途徑或 醋酸-甲羥戊酸途徑，產(chǎn)生以異黃酮類(lèi)為主的植保素，直接殺死入侵的病原體， 抑制病斑的擴(kuò)大。在外源激發(fā)子的處理下豆科植物也能夠產(chǎn)生抗性反應(yīng)，合 成植保素。大豆子葉法就是利用激發(fā)子處理大豆子葉，然后通過(guò)測(cè)定子葉產(chǎn) 生的植保素的量，來(lái)表示激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗性活性的方法。
大豆的培養(yǎng)：大豆種子用水洗凈后，用8%次氯酸鈉溶液滅菌20min，再 用無(wú)菌水沖洗干凈，暗光震蕩24h。次日將種子播種在鋪有蛭石的培養(yǎng)盒中， 置于培養(yǎng)箱中（光照：黑暗=16h: 8h)交替培養(yǎng)10d，待大豆長(zhǎng)出兩片真葉 后即可進(jìn)行活性測(cè)定。
活性測(cè)定方法：
剪下已經(jīng)長(zhǎng)出兩片真葉的大豆子葉，用8%次氯酸鈉溶液滅菌5min，然 后用無(wú)菌水沖洗干凈，再用濾紙吸干。在無(wú)菌條件下用刀片削去子葉外表皮 厚約1mm，直徑約6mm的傷口，用無(wú)菌水浸泡清洗，約30sec后取出，用
67
濾紙拭干后放入鋪有濕濾紙培養(yǎng)皿中，每皿放10片子葉作為一個(gè)處理。每個(gè) 樣品五個(gè)處理，每處理重復(fù)兩次，對(duì)照用水。取配置好的樣品溶液（含有 2mg/ml的鏈霉素）10pl加在傷口上。處理后的子葉在25°C黑暗的溫箱中培 養(yǎng)24h,將每皿中的子葉轉(zhuǎn)移到一個(gè)盛有10ml雙蒸水的試管中，充分震蕩后 測(cè)定〇Dm。
結(jié)果及討論：
黃原膠寡糖具有一定的植物誘抗活性，當(dāng)寡糖濃度為1000ppm時(shí)達(dá)最高 值0.73,與對(duì)照相比具有顯著性的差異。低劑量時(shí)殼寡糖的植物誘抗活性要 略高于黃原膠寡糖（見(jiàn)圖4-9, 4-10)。
0.9
0.8
0.7
9820
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
CK 50ppm 100ppm 200ppm 1000ppm 6000ppm
Oligoxanthan concentration
圖4-9黃原膠寡糖大豆子葉法測(cè)定植物誘抗活性 Figure 4-9 Result of Oligoxanthan by Soybean Cotyledon Bioassay
68
1.0
0.9
0.8
0.7
98cJa〇
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1 0.0
CK 25ppm 50ppm 100ppm 500ppm 1000ppm
Chitooligosaccharide concentration
圖4-10殼寡糖大豆子葉法測(cè)定植物誘抗活性 Figure 4-10 Result of Chitooligosaccharide by Soybean Cotyledon Bioassay
4.5本章小結(jié)
對(duì)黃原膠寡糖的生物學(xué)活性進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)：
(1)黃原膠寡糖具有很強(qiáng)的體外清除活性氧的能力，對(duì)羥自由基、超氧陰 離子自由基、DPPH自由基均有不同程度的清除作用。同時(shí)對(duì)由H2O2 誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞溶血具有很好的抑制作用。
(2)黃原膠寡糖有一定的抑制皮膚淺部真菌生長(zhǎng)的作用。
(3)黃原膠寡糖幾乎沒(méi)有ACE抑制活性。
(4)黃原膠寡糖有較強(qiáng)的植物誘抗活性。
凝集素是一類(lèi)具有凝集細(xì)胞或沉降復(fù)合糖質(zhì)作用的非免疫起源的蛋自質(zhì) 或糖蛋白，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。凝集素的發(fā)現(xiàn)距今己有100多年 的歷史了，其最初的研究目的主要是為了闡明藥用植物物質(zhì)的毒性機(jī)理，以 及用于刺激產(chǎn)生抗體的免疫學(xué)研究。自二十世紀(jì)六十年代，凝集素研究發(fā)展 到了一個(gè)新的階段，人們開(kāi)始從分子水平更廣泛、更深入的研究這類(lèi)物質(zhì)。 如今，凝集素作為抗腫瘤藥物的研究已經(jīng)發(fā)展到了一定階段。它的作用是通 過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用提高機(jī)體免疫力從而殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用 很低，與傳統(tǒng)的放化療及化學(xué)合成藥物相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
微生物凝集素(microbial lectins, ML)最先發(fā)現(xiàn)的時(shí)間是1908年，黃原膠寡糖酶法制備及水解酶分泌菌株的定性,Gugot 從大腸桿菌(Escherichia coli)中找到了能凝集血細(xì)胞的凝集素。至今，已發(fā)現(xiàn) 了 208種以上的ML物質(zhì)[1]。分析得知，常見(jiàn)的ML在微生物體的部位為細(xì) 胞表面。它們可以與細(xì)胞聯(lián)系不密切，如特定的表面細(xì)胞器上，包括細(xì)菌菌 毛(firnbria)或纖毛(pili)。這些物質(zhì)有時(shí)被稱(chēng)作為粘附素(adhesins)，它們中許 多具凝血能力。
如同多數(shù)其他生物來(lái)源的凝集素一樣，大多數(shù)ML的一個(gè)重要特性是對(duì) 某些/某種糖有結(jié)合性能，它具有可變換性和非共價(jià)性，其中有的結(jié)合能力的 特異/專(zhuān)一性很強(qiáng)。迄今發(fā)現(xiàn)與ML結(jié)合的糖及其衍生物之范圍雖然有限，但 也達(dá)60種以上。分析認(rèn)為，這些糖大多屬于單糖、寡糖或者雙糖之類(lèi)，而以 甘露糖為多見(jiàn)，其次是半乳糖等。與同病原菌發(fā)生反應(yīng)的動(dòng)植物凝集素的結(jié) 合的糖種類(lèi)相比，有一定差別[2]。
ML之所以如此引人注目，一是因?yàn)檠芯课⑸锉旧硭琛Ｄ厥俏⑸?物自身進(jìn)化發(fā)展之需。一些微生物，包括各類(lèi)病原菌，需要與寄主發(fā)生各種 關(guān)系以發(fā)展自己。它們的凝集素可以是感染動(dòng)物的毒力決定子，其中以大腸
72
桿菌對(duì)甘露糖和galgal-專(zhuān)一的菌毛凝集素為突出例子。二是因?yàn)橐恍㎝L 有助于其產(chǎn)生菌選擇識(shí)別寄主的表皮細(xì)胞，或者識(shí)別高等動(dòng)物的白細(xì)胞。在 此，該凝集素起著細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用中的識(shí)別分子(recognition molecules) 作用[3]。凝集素在此起識(shí)別活動(dòng)的決定子(determinat)作用，如粘球菌 (Myxococcus)的細(xì)菌所顯示的那樣。這說(shuō)明ML在介導(dǎo)各種正常和病理過(guò)程 中都起重要作用[4]。
試驗(yàn)材料：
1)血紅細(xì)胞的制備
人的B型血樣和小鼠由大連醫(yī)科大學(xué)提供，動(dòng)物血樣取自大連市長(zhǎng)興農(nóng) 貿(mào)市場(chǎng)。均取全血，用3.8 °% (M/M)枸櫞酸鈉溶液抗凝，各抗凝血經(jīng)2000 r/min 離心10 min除去血漿，加10倍體積的TBS溶液充分洗滌，然后經(jīng)1000 r/min 離心3 min去上清液，重復(fù)4次，最后經(jīng)2500 r/min離心3min, —部分配成 2% (V/V)的TBS-Ca2+紅細(xì)胞懸浮液；另一部分配成不含Ca2+的2 % (V/V) 的TBS紅細(xì)胞懸浮液。
將紅細(xì)胞懸浮于10ml TBS中，加入2mg胰蛋白酶，37°C下消化1.5小時(shí)。 然后用TBS洗3次，在TBS中配成2%紅細(xì)胞懸浮液。
2)菌懸液的制備
將菌種接種于黃原膠固體培養(yǎng)基上，于30C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2天， 待新生菌體長(zhǎng)出后，用 TBS-Ca2+溶液（TBS: 0.14 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl，pH=7.4; TBS-Ca2+: TBS 中含 0.01 mol/L CaCb，pH=7.4)洗下菌
落制成菌懸液。
黃原膠固體培養(yǎng)基組成：瓊脂粉2%，蛋白胨0.1%，酵母浸出粉0.1%， 黃原膠0.3°%，葡萄糖0.2°%，水97.3%。
73
試驗(yàn)方法：
活力測(cè)定在96孔U型微量血凝板中進(jìn)行。先在每孔中加入25^L TBS-Ca2+ 溶液，再往第1孔中加入25^L樣品，混勻后，再?gòu)牡?孔中吸取25^L上述混合 液加入第2孔，以此類(lèi)推作倍比稀釋?zhuān)詈笤诿靠字屑尤?5^L2 % (V/V)的 TBS-Ca2+溶液紅細(xì)胞懸浮液，振蕩搖勻，在室溫放置1?2小時(shí)后，肉眼觀察。 如紅細(xì)胞不發(fā)生凝集則在“U”型血凝板小孔內(nèi)沉于孔底形成一界線清晰的紅 色小點(diǎn)；如發(fā)生凝集，紅細(xì)胞之間則形成一似網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)散的紅斑塊。以有紅細(xì) 胞凝集活力的最大稀釋度為該凝集素樣品的凝集活力(凝集效價(jià))，記為2n，以 TBS-Ca2+作空白對(duì)照。
結(jié)果與討論：
XT-11菌懸液對(duì)人的B型血及家兔、家雞、家鴿、小鼠等4種動(dòng)物紅細(xì) 胞的凝集效價(jià)見(jiàn)表5-1。鞘氨醇單胞菌XT-11菌懸液對(duì)家兔的紅細(xì)胞凝集作 用最強(qiáng)，凝集效價(jià)為26；對(duì)家雞的凝集作用次之，為24；它不凝集小鼠和家 鴿的紅細(xì)胞，同時(shí)也不凝集人的B型紅細(xì)胞以及胰蛋白酶處理的人的B型紅 細(xì)胞。
表5-1鞘氨醇單胞菌的凝集活性 Table 5-1 Hemagglutinationg activity of Sphingmonas sp.
紅細(xì)胞類(lèi)型凝集效價(jià)紅細(xì)胞類(lèi)型凝集效價(jià)
人B型0家鴿0
胰蛋白酶處
0家雞24
理后的人B型
家兔26小鼠0
74
試驗(yàn)方法：
選取16種單糖、寡糖和糖蛋白，分別制成濃度為200 mmol/L的溶液。黃原膠寡糖酶法制備及水解酶分泌菌株的定性, 往每一孔中加入25^L糖溶液，然后加入25^L囷懸液，最后往各孔中加入 25^L的2% (V/V)的兔紅細(xì)胞-TBS-Ca2+懸浮液，在室溫下靜置2小時(shí)后，檢 查凝集情況。
結(jié)果與討論：
表5-2為16種糖對(duì)鞘氨醇單胞菌懸液凝集兔紅細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示： 只有肝素可抑制菌懸液對(duì)兔血紅細(xì)胞的凝集作用。至于其他糖類(lèi)是否可以抑 制其對(duì)兔血紅細(xì)胞的凝集作用，還有待于進(jìn)一步的證明。
表5-2糖和糖蛋白對(duì)鞘氨醇單胞菌懸液血紅細(xì)胞凝集活性的抑制作用 Table 5-2 Inhition of hemagglutination activity XT-11
抑制劑能否抑制抑制劑能否抑制
半乳糖-Heparin+
甘露糖-D(-)Ribose-
N-乙酰半乳糖酰胺-Mucin-
N-乙酰葡萄糖酰胺-Asialo-mucin-
巖藻糖-硫酸軟骨素-
葡萄糖-& -Nitrophenyl-a-D-galactopyranose-
Metalose-D(+)Glucosamir hydrochloride-
Lactose-Thyroglobulin-
5.3熱穩(wěn)定性 試驗(yàn)方法：
將菌懸液樣品分別在4°C冰箱及溫度為20°C，30°C，37°C，40°C，50°C， 60 °C的恒溫水浴中處理30min，測(cè)定各樣品的凝集活力。
結(jié)果與討論：
75
pH
1菌懸液血凝活性溫度依賴(lài)性圖5-2菌懸液血凝活性pH依賴(lài)性
uence of temperature on the agglutinative activity Figure 5-2 Influence of pH on the agglutinative activity
則定pH對(duì)菌懸液凝集活性影響時(shí)，使用下列緩沖液：pH為4~6的 LAC緩沖液；pH為7~9的^^-只0緩沖液;pH為10?11的Gly-NaOH緩沖 血清樣品的pH值調(diào)至4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0，在4°C密封
中放置2小時(shí)，然后將各溶液的pH值調(diào)至7.4,測(cè)定各樣品的凝集活力。 討論：
-11菌懸液在不同pH值條件下的凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，菌懸液中的凝集素 [的變化比較敏感（圖5-2).由于在pH值低于5或高于10時(shí)兔紅細(xì)胞發(fā)生 部分溶血現(xiàn)象，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，因此沒(méi)有統(tǒng)計(jì)在結(jié)果中，但從圖2 看出鞘氨醇單胞菌的凝集活性具有一定的pH值穩(wěn)定性。在pH為6.0?
76
10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。
5.5 Ca2+對(duì)血凝活力的影響 試驗(yàn)方法：
取菌懸液25^L，在96孔U型板中與等量的TBS溶液經(jīng)系列倍比稀釋后， 黃原膠寡糖酶法制備及水解酶分泌菌株的定性,每孔分別加入25^L的10，20，40 mmol/L的EDTA溶液，用2% (V/V)的兔 紅細(xì)胞-TBS懸浮液檢測(cè)其活性；若活性降低或消失，則加入0.05mol/L TBS-Ca2+溶液，觀察其活性的變化。對(duì)照組用TBS-Ca2+溶液作倍比稀釋?zhuān)?2% (V/V)的兔紅細(xì)胞-TBS-Ca2+懸浮液檢測(cè)其活性。
結(jié)果與討論：
金屬離子螯合劑EDTA對(duì)XT-11菌懸液的凝集活力沒(méi)有抑制作用。將XT-11 菌懸液在40 mmol/L EDTA溶液中透析過(guò)夜后，在不含Ca2+的TBS緩沖液中透 析，然后測(cè)定其血凝活性。同時(shí)在分別加入10，20，30，40 mmol/L Ca2+的 TBS緩沖液中測(cè)定其血凝活性。發(fā)現(xiàn)它的血凝活性沒(méi)有任何變化。這表明 XT-11菌懸液的血凝活性不受EDTA的影響，不依賴(lài)于Ca2+。
5.6鞘氨醇單胞菌XT-11的粗提蛋白對(duì)血凝活性的影響 試驗(yàn)方法：
將鞘氨醇單胞菌XT-11在KS-250型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波科生儀器廠， 中國(guó)）上粉碎20 min，用含0.15 mol/LNaCl的TBS溶液在4°C抽提過(guò)夜。 5000r/min離心20 min取上清液。加入硫酸銨到70。%濃度。5000r/min離心20min， 收集沉淀，溶于含0.15 mol/LNaCl的TBS溶液中，在此緩沖液中透析除去硫 酸銨。測(cè)定其血凝活性。
結(jié)果與討論：
鞘氨醇單胞菌XT-11的蛋白樣物質(zhì)經(jīng)硫酸銨鹽析、TBS溶解蛋白沉淀、透
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析脫鹽后，獲得的粗提蛋白溶液，發(fā)現(xiàn)其仍然具有血凝活性。
5.7本章小結(jié)
鞘氨醇單胞菌XT-11懸液能凝集2種血紅細(xì)胞。菌懸液對(duì)兔紅細(xì)胞的凝集
可以被肝素所抑制。其凝集活性不依賴(lài)于Ca2+;在pH為6.0?10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)
定；它的凝集活性在60°C時(shí)完全喪失。以上結(jié)果表明：該菌含有具有紅細(xì)胞
凝集活性的物質(zhì)。
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