由于基因載體可以運(yùn)輸治療基因進(jìn)人生物有機(jī)體內(nèi)進(jìn)行治療，羧甲基纖維素鈉接枝共聚物的合成與表征，而基因載體的安全和高效性是影響 基因治療效果的關(guān)鍵因素，因此尋找安全、高效率的基因載體備受關(guān)注[1].相對(duì)于病毒載體，非病毒 基因載體具有可預(yù)測(cè)的安全性、種類多樣、可直接生產(chǎn)及定量控制運(yùn)載量等優(yōu)勢(shì).但這些載體依然存 在基因轉(zhuǎn)染效率低、不能將治療基因靶向轉(zhuǎn)運(yùn)到目標(biāo)細(xì)胞及其核內(nèi)等問(wèn)題[2].傳統(tǒng)的高分子基因載體 一般都是聚陽(yáng)離子，可以與脫氧核糖核酸（DNA)通過(guò)靜電作用形成納米復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn) 載[3,4].但這種納米復(fù)合物結(jié)構(gòu)相對(duì)無(wú)序，比較難以控制，因此穩(wěn)定性較差.如果將DNA和高分子相 結(jié)合形成嵌段的雜化高分子，再進(jìn)行自組裝，形成結(jié)構(gòu)可調(diào)、高度有序的多功能納米復(fù)合物，有望提 高基因的轉(zhuǎn)染效率[5]. DNA和高分子的雜化物將具有很好的穩(wěn)定性及良好的生物相容性和生物活性, 在體內(nèi)不產(chǎn)生毒副作用[6,7].本課題組對(duì)DNA的功能化修飾和自組裝進(jìn)行了大量研究，并取得一定的 成果[8?13].

目前，DNA與高分子進(jìn)行雜化的方法主要有3種：（1)將DNA末端修飾成可聚合基團(tuán)，再利用引 發(fā)劑引發(fā)含有DNA的單體進(jìn)行聚合，得到側(cè)鏈接枝DNA的共聚物[14，15]; (2)將已合成好的高分子鏈 通過(guò)活性基團(tuán)直接連接到有活性末端的DNA上，例如合成丙烯酸側(cè)鏈接枝單鏈DNA齊聚物（ODNs) 和N，N-二甲基丙烯酰胺共聚物接枝ODNs的雜化接枝共聚物[16，17]; (3)在高分子鏈上引人活性位點(diǎn)， 再以高分子鏈為骨架，利用固相合成將DNA合成單體逐步連接到高分子鏈上，最后脫保護(hù)得到接枝 DNA分子鏈的高分子接枝共聚物[18].與第2種方法相比，第3種方法提到的固相合成方法提高了接枝 效率，但固相合成的DNA分子鏈長(zhǎng)度不等，而且許多合成的鏈?zhǔn)清e(cuò)誤的.因此，如果將該材料用于檢 測(cè)DNA或轉(zhuǎn)載基因，效果并不好[19].聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，可看作生物體 外的特殊DNA復(fù)制，用于擴(kuò)增特定的DNA片段.Herrmann等[5,20]對(duì)DNA與高分子通過(guò)化學(xué)鍵連接形 成雜化嵌段共聚物做了大量研究，并證明了 PCR是實(shí)現(xiàn)與高分子連接的ODNs擴(kuò)增的有效途徑，解決 了第2種方法中DNA片段比較短和第3種方法中DNA序列不穩(wěn)定的問(wèn)題.

羧甲基纖維素鈉（CMC)在水中具有良好的溶解性，無(wú)毒且具有良好的可降解性和生物活性以及人體相容性[21];而且CMC的分子鏈上眾多的羧基可以用來(lái)修飾，適合作為與DNA結(jié)合的原料.但水 溶液中纖維素上的羧基活性不足以與DNA上修飾的氨基反應(yīng)，需要使用活性酯活化羧基促使酰胺鍵 的生成.因此，本文以CMC作為接枝共聚物主鏈，用1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC)和 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)活化CMC,然后與5'端有氨基修飾的單鏈DNA齊聚物（ODNs-NH2)反應(yīng)，得 到CMC的側(cè)鏈上接枝ODNs的共聚物，并以其為引物，通過(guò)PCR得到CMC側(cè)鏈上接枝DNA的共聚 物，采用傅里葉紅外光譜儀和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了初步的表征.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

CMC(Mw = 2.5xl05, DS = 1.2)，EDC和N-異丙基乙二胺，羧甲基纖維素鈉接枝共聚物的合成與表征，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NHS，阿 拉丁公司；ODNs-NH2(PCR 上游引物，Mw = 8235,堿基序列為 5'NH2-GTC ACC AGT GCA GTG CTT GAT AAC AGG 3')、PCR 試劑盒、ODNs’（PCR 下游弓丨物，堿基序列為5'GAT GAC GCA TCC TCA CGA TAA TAT CCGG3')、Lambda DNA和1000 bp DNA Marker P，生工上海生物工程有限公司；PCR純化試 劑盒，德國(guó)Qiagen公司；1000 bp DNA Ladder■，碧云天生物技術(shù)研究所.

5334型PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Eppendorf公司；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠； KODAK Gel Logic 2200型凝膠成像儀，日本柯達(dá)公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR)， 美國(guó)Nicolet公司.

1.2 CMC-g-DNA接枝共聚物的合成

合成路線如Scheme 1所示.

首先參照文獻(xiàn)[22]方法制備NHS-CMC中間體，分別在中性及酸性條件下對(duì)CMC進(jìn)行活化.將一 定量的CMC溶解在中性磷酸鹽(PBS，pH = 7. 2)緩沖溶液中，配成2 mg/mL的溶液；將EDC和NHS分 別溶解在PBS緩沖溶液中，配成5 mg/mL的EDC溶液和NHS溶液.分別取680 ^L CMC溶液、120 ^L EDC溶液和200 ^L NHS溶液加人到2 mL離心管中，使EDC和NHS的濃度分別為0. 6和1 mg/mL， 將離心管置于25丈水浴反應(yīng)24 h.將反應(yīng)液用截留分子量為3x104的超濾管進(jìn)行純化，除去溶劑和未 反應(yīng)的ODNs，EDC和NHS.最后將產(chǎn)物溶解在PBS緩沖溶液中，使活化后的CMC濃度為20 ^mol/L. 取一部分活化CMC樣品，用大量乙醇沉淀；沉淀物多次離心洗滌后于25丈干燥，用于FTIR表征.

將0. 68 g磷酸二氫鉀加人到15. 2 mL 0. 1 mol/L氫氧化鈉溶液中，用水稀釋至100 mL,配成pH = 6.5的磷酸鹽緩沖溶液，同時(shí)調(diào)整EDC和NHS的質(zhì)量比為1:2,即EDC終濃度為0.5mg/mL, NHS終 濃度為1 mg/mL,然后按相同的方法進(jìn)行CMC的活化.

取100 ^L活化后的CMC溶液，加人100 ^L濃度為100 ^mol/L的ODNs-NH2溶液（pH=7. 2)和

3^L N-異丙基乙二胺，使CMC與ODNs的摩爾比為 反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量為3xl04的超濾管對(duì)產(chǎn) 物進(jìn)行純化，得到CMC-g-ODNs接枝共聚物.

將CMC-g-ODNs接枝共聚物作為PCR過(guò)程的 上游引物，通過(guò)設(shè)計(jì)下游引物，以Lambda DNA為 模板，按照?qǐng)D1所示過(guò)程，可以得到DNA長(zhǎng)度為 1300個(gè)堿基對(duì)（1300 bp)的CMC-g-DNA接枝共聚 物.PCR過(guò)程結(jié)束后，用PCR純化試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn) 行純化.向反應(yīng)液(50 ^L)中加人250 ^LPBS緩沖 液，然后將PCR產(chǎn)物和PBS的混合液加人2 mL的 純化柱中，以1.3x104r/min離心60s，除去收集管 內(nèi)的液體，即短片段DNA.向純化柱內(nèi)加人750 ^L PBS-EDTA緩沖溶液（PE，含有乙醇使DNA沉淀）， 以1. 3x104 r/min轉(zhuǎn)速離心60 s，洗去雜質(zhì).除去收 集管內(nèi)的液體，再次將純化柱在1. 3 x104 r/min下 離心60 s，除去殘留液并使殘留的乙醇充分揮發(fā). 將純化柱插人到干凈的1. 5 mL離心管內(nèi)，加人60 ^LEB(PCR試劑盒自帶）緩沖溶液中，靜置1 min 后，離心60 s(1. 3x104 r/min)，最后將離心管內(nèi)的 產(chǎn)物溶液在-20丈下保存.

1.3凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的水平式瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)CMC-g-ODNs.分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的水平式瓊 脂糖凝膠電泳和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳表征CMC-g-DNA產(chǎn)物.

2結(jié)果與討論

2.1 FTIR 表征

羧酸一旦成鹽，形成羧酸根負(fù)離子（, 2個(gè)C=0鍵相同，羧甲基纖維素鈉接枝共聚物的合成與表征，因而有對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)2 個(gè)吸收帶.CMC在不同條件下活化前后的紅外光譜如圖2所示.可以看出，未活化的CMC在1608和

1425 cm-1處有CMC-Na分子中羧酸鈉鹽中羧酸根 負(fù)離子的特征吸收峰，羧酸的鈉鹽在1650?1850 cm-1處無(wú)C = O雙鍵的特征吸收峰；1118 cm-1處 為纖維素中醚結(jié)構(gòu)C一O—C的伸縮振動(dòng)吸收峰; 1060 cm-1處為纖維素醚yS-(1，4)二苷鍵的特征吸收 峰.因此，如果活化成功獲得中間產(chǎn)物，則在 1650?1850 cm-1處會(huì)有C = O的特征吸收峰出現(xiàn). 由圖2可見(jiàn)，在中性和酸性條件下，1720 cm-1處均 出現(xiàn)叔酰胺中酯基的特征吸收峰，1326 cm-1處為 C一N鍵的特征吸收峰，說(shuō)明生成了 CMC和NHS 的中間產(chǎn)物.圖2譜線b中1654 cm-1中應(yīng)為

Scheme 1中第一步反應(yīng)CMC與EDC生成的中間產(chǎn)物中C N的特征吸收峰，表明在中性條件下，只 有部分羧酸鹽被活化，而在酸性條件下對(duì)CMC的活化效果更好.

2.2凝膠電泳

對(duì)于相同堿基對(duì)數(shù)的DNA,在同樣濃度的水平式瓊脂糖凝膠電泳中遷移速率是相同的.由圖3可 以看到，在中性條件下活化時(shí)，接枝在CMC上的 ODNs(泳道3)相對(duì)于未接CMC的ODNs(泳道2)

有一定滯后.而在酸性條件下活化后，接枝在CMC 上的ODNs的條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象（泳道4)，說(shuō)明 CMC上接枝了若干個(gè)ODNs，同時(shí)也說(shuō)明CMC在酸 性條件下的活化效果更好，表明CMC側(cè)鏈上的羧 基活化率更高.

將所得CMC-g-ODNs用于PCR過(guò)程，產(chǎn)物分別 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為設(shè)的水平式瓊脂糖凝膠電泳和質(zhì)量Fig. 3 Picture of 3% horizontal agarose gel electropho-

分?jǐn)?shù)為5%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行resis of 1000 bp DNA Marker P ( lane 1 )，

檢測(cè).瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖4 ( A)所示.unreacted ODNs (lane 2)，CMC-g-ODNs (lane

圖4(A)中泳道3中出現(xiàn)了 2個(gè)條帶，與對(duì)照組（泳3, CMC activated at pH = 7. 2 ) and CMC-g-

道2)在同一水平線上的條帶為ODNs進(jìn)行PCR后〇DNs(lane4, CMC activated at pH = 6.5)

得到長(zhǎng)度為1300 bp的DNA，而在其下方的顏色較淺的條帶應(yīng)為CMC-g-DNA產(chǎn)物.表明CMC-g-ODNs (泳道4)在1%瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率大于CMC-g-DNA產(chǎn)物.而在垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠 電泳[圖4(B)]中，泳道2也出現(xiàn)了 2個(gè)條帶，不同的是產(chǎn)物條帶出現(xiàn)的位置與對(duì)照組相比出現(xiàn)了 滯后.

由于聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)劑在引發(fā)劑過(guò)硫酸銨及催化劑 N,N,N',N'-四甲基二乙胺作用下形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的水凝膠，而聚丙烯酰胺凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)，因此可以起到分子篩的作用，對(duì)樣品進(jìn)行分離.對(duì)于變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，DNA在其中的移 動(dòng)速率只與分子量的大小有關(guān)，因而變性凝膠電泳可以起到分離不同大小DNA的作用.1300 bp的 DNA只有1個(gè)條帶，如圖4(B)中的對(duì)照組（泳道1)所示；與CMC接枝后，出現(xiàn)了 2個(gè)條帶，如圖4 (B)中泳道2所示，與對(duì)照組在同一水平線上的為ODNs進(jìn)行PCR后得到的1300 bp DNA,泳道內(nèi)上 方的條帶為CMC-g-DNA產(chǎn)物.CMC-g-DNA遷移速率相對(duì)于對(duì)照組出現(xiàn)滯后，與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 相反，說(shuō)明CMC接枝上DNA后，DNA的分子量增加.同時(shí)說(shuō)明圖4(A)泳道2中的淺色條帶不是由于 未PCR的CMC-g-ODNs的引起的，而是CMC-g-DNA產(chǎn)物.圖4中CMC-g-DNA產(chǎn)物未出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象且 條帶顏色較淺，說(shuō)明接枝在CMC上的ODNs PCR成功率不夠高，羧甲基纖維素鈉接枝共聚物的合成與表征，可能每個(gè)CMC上只有一個(gè)ODNs擴(kuò) 增.可見(jiàn)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳以及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，證明合成出了 CMC-g-DNA產(chǎn)物，并且 在1%的瓊脂糖凝膠電泳中，CMC使得1300 bp DNA的移動(dòng)速率加快，而在聚丙烯酰胺凝膠電泳中， CMC使1300 bp DNA的移動(dòng)速率減慢.

3結(jié) 論

利用化學(xué)合成和生物合成的方法制備了 CMC-g-DNA接枝共聚物，并對(duì)中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物進(jìn)行 了表征.結(jié)果表明，CMC在酸性緩沖溶液中比在中性緩沖液中的活化效率更高.凝膠電泳的結(jié)果表 明，接枝上CMC的DNA遷移速率發(fā)生了改變，證明最終產(chǎn)物的生成，同時(shí)也說(shuō)明CMC所帶的負(fù)電荷 可以加快1300 bp DNA在1%水平式瓊脂糖凝膠電泳過(guò)程中的遷移速率，減慢其在垂直板變性聚丙酰 胺凝膠電泳中的遷移速率.