發(fā)生與許多因素有關(guān)，而低密度脂蛋白（LDL)的 升高及由此引起LDL進(jìn)入血管壁并被氧化成氧化 的低密度脂蛋白以及纖維蛋白原含量的増加，從而 破壞了內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝、屏障作用都是產(chǎn)生動脈粥 樣硬化的主要原因12。如果能較大程度的清除纖維 蛋白原(Fib),同時又降低血液中過高的LDL含量

配制0. 2%的黃原膠溶液，分別用移液管取5 ?: 722分光光度計;恒溫水浴鍋（HH-2A)電s力丨sl此4此3此2 mL溶液，加入5此8 mL、9

的話，對于改善血液流變指標(biāo)、改善血液狀況和防治 高粘滯血癥都具有積極作用131，也能有效的預(yù)防和 阻止AS發(fā)生141。目前血液LDL凈化方法主要包 括血漿置換、膜過濾、免疫親合吸附、物理化學(xué)吸附 及肝素誘導(dǎo)沉淀等技術(shù)而對誘導(dǎo)沉淀的研究多集 中于類肝素物質(zhì)，如磺化多糖類物質(zhì)5。

黃原膠是甘蘭黑腐病黃單胞菌（Xanthomonas Camparis)所產(chǎn)生的一種胞外多糖，具有聚P-1，4-口比 喃型葡萄糖的主鏈以及含糖的側(cè)鏈如丙酮酸和乙酸 基因，其聚合物骨架結(jié)構(gòu)類似于纖維素，側(cè)鏈上的葡 萄糖醛酸和丙酮酸群賦予了黃原膠負(fù)電荷。整個分 子結(jié)構(gòu)中則含有大量的伯、仲醇羥基16。通過磺酸 基化反應(yīng)可以使所得衍生物具有大量硫酸基，而以 3^氯-2-羥基丙磺酸鈉為磺化試劑所得到的降解黃原 膠磺酸基化衍生物應(yīng)用于血漿脂蛋白誘導(dǎo)沉淀技術(shù) 鮮見報道171。以該種降解黃原膠磺酸基化衍生物作 為凈化劑，通過誘導(dǎo)沉淀的方式，調(diào)節(jié)血漿pH值， 從而使凈化劑能夠與LDL/Fib結(jié)合形成不溶性的 復(fù)合物而沉淀，通過過濾以達(dá)到凈化血漿中LDL/ Fib的目的。

文獻(xiàn)報道有以海藻酸鈉，魔芋葡甘聚糖，降解香 豆膠等一些天然多糖為原料，通過降解和磺化，得到 一系列降解多糖磺化衍生物，運用于體外血漿凈化， 都得到了良好的凈化效果|wq。

本文以黃原膠為原料，通過降解、磺化獲得一種 新型類肝素物質(zhì)一降解黃原膠磺酸基衍生物。這 是一種聚陰離子酸性低聚糖，含有硫酸基團(tuán)，具有良 好的水溶性。本文研究和討論了磺化反應(yīng)中降解黃 原膠的相對分子質(zhì)量、3-氯-2-羥基丙磺酸鈉用量，反 應(yīng)時間對產(chǎn)物磺酸基含量的影響，通過實驗確定了 較優(yōu)的反應(yīng)條件。同時以降解黃原膠磺化衍生物為 凈化劑，考察其選擇性清除血漿中LDL和Fib的性 能。分別研究了凈化劑用量、凈化體系的pH值對 凈化效果的影響，確立較優(yōu)的凈化條件，從而證明了 降解黃原膠磺酸基衍生物是一種新型的血液凈化 劑。

1材料和方法

1.1原料與試劑

黃原膠(上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠)、新鮮豬血、透 析袋(截留相對分子質(zhì)量3500,上海源聚生物科技 有限公司）、環(huán)氧氯丙烷、亞硫酸氫鈉(AR，上海凌峰 化學(xué)試劑有限公司）、鹽酸、醋酸鈉、冰醋酸、乙醇等 試劑為市售分析純或化學(xué)純。

1.2主要儀器

離心機(80-2);循環(huán)水式真空泵(SH2-D型）真空干 燥箱(DZF-6020型）精密酸度計（PHS-3C型）烏 氏粘度計。

1. 3實驗方法

1.3.1降解黃原膠的制備

取一定量的黃原膠分散于100 mL乙醇溶液 中，置于250 mL三口燒瓶。加入一定量的HCl溶 液恒溫水浴，攪拌使黃原膠分散均勻，反應(yīng)停止后抽 濾，置于烘箱中烘干。

1. 3.2 3-氯-2-羥基丙磺酸鈉的制備1111

稱取49.96 g環(huán)氧氯丙烷、64. 6 g亞硫酸氫鈉， 量取130 mL的去離子水，置于三口燒瓶中，控制反 應(yīng)溫度為80 °C。滴加環(huán)氧氯丙烷，滴加的同時不斷 攪拌，滴加完畢后，反應(yīng)1.5 h。

反應(yīng)完畢后，將燒瓶內(nèi)的產(chǎn)物趁熱倒入大燒杯 中，冷卻至室溫后用冷水冷卻至大量的白色晶體析 出，進(jìn)行抽濾，用濾液充分洗滌殘留于燒杯壁的產(chǎn) 物，最后得純凈的白色產(chǎn)物。

1.3.3磺酸基降解黃原膠的制備

取1 g降解黃原膠加入裝有攪拌及回流冷凝裝 置的250 mL三口燒瓶中，加入40 mL乙醇溶液和 一定量的3^氯-2-羥基丙磺酸鈉，于60 °C下進(jìn)行磺 化反應(yīng)3 h。

反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物倒出，抽濾，得到粉狀固體 于60 °C下烘干。

1.3.4純化處理

將干燥后的磺酸基降解黃原膠溶于去離子水后 移入透析袋中，磺酸基降解黃原膠選擇性清除血漿的研究,以去離子水充分透析，直至透析液以 BaCL溶液檢驗無SO4^檢出。透析液濃縮后在50 °C下真空干燥至恒重，即獲得純凈的降解黃原膠磺 酸基化衍生物。

1.3.5血漿Fib及脂蛋白的誘導(dǎo)沉淀

以冰醋酸和醋酸鈉配制不同pH值的HAc- NaAc緩沖溶液，同時將不同量的磺酸基降解黃原 膠溶解其中，獲得不同濃度不同pH值的凈化劑緩 沖溶液。取一定量的血漿按1 :1體積比加入上述 凈化劑緩沖溶液中，體系有沉淀物形成。于 3 000 r/min下離心分離沉淀物，取上清液分析纖維 蛋白原（Fib)、血漿總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽 固醇(HDL)及血漿總蛋白質(zhì)(TP)等指標(biāo)。

1.4分析指標(biāo)與方法

1)降解黃原膠的相對分子質(zhì)量：粘度法測 

mL、8 mL去離子水，稀釋成濃度為1/2、1/3、1/4、 V5的溶液，將烏氏粘度計垂直放入恒溫槽中，調(diào)節(jié) 恒溫槽溫度為25 °C。用移液管取10 mL去離子水 注入粘度計，待恒溫后用秒表測量溶劑流經(jīng)毛細(xì)管 的時間to。重復(fù)3次，每次相差不應(yīng)超過0.2 s取 其平均值。取10 mL經(jīng)稀釋的黃原膠溶液加入粘 度計中，分別測定1/2、1/3、1/4、U5的溶液的流 出時間t1、t2、t3、t4。作lnn/c?c圖，從截距求出[n 值。

由黃原膠的半經(jīng)驗Mark-Houwink方程[n二 1.7X 10^XM1’14可求出黃原膠的相對分子質(zhì)

量[13]。

2)測定產(chǎn)物磺酸基含量:硫酸鋇比濁法[14。

3)血漿纖維蛋白原濃度(CFib):亞硫酸鈉沉淀- 雙縮脲顯色法[15]。

4)血漿(血清）總膽固醇濃度（crc):乙醇抽提， 磷硫鐵顯色法[16]。

結(jié)果與討論

2.1降解黃原膠的制備條件優(yōu)化

黃原膠的糖苷鍵在堿性介質(zhì)中是相當(dāng)穩(wěn)定的， 但是在酸性介質(zhì)中容易斷裂。因此可以通過改變酸 的濃度、溫度，水解時間等進(jìn)行酸降解得到不同的 相對分子質(zhì)量(見圖1)。

2.2磺化實驗條件的優(yōu)化

由于黃原膠粘度較大，過高的溫度，反應(yīng)時間過 長或反應(yīng)體系水含量較多都會使反應(yīng)物糊化結(jié)塊， 使得反應(yīng)無法進(jìn)行，所以將磺化的反應(yīng)溫度控制在 60 C

2.2. 1黃原膠的相對分子質(zhì)量對磺酸基含量的影 響

固定降解黃原膠用量為1 g反應(yīng)溫度為60 C 反應(yīng)時間定為3 h，3-氯-2-羥基丙磺酸鈉的用量為5 g。黃原膠相對分子質(zhì):

由表1可知，隨著黃原膠水溶液相對分子質(zhì)量 的減小，所得產(chǎn)物磺酸基含量更高?；撬峄到恻S原膠選擇性清除血漿的研究,這是因為隨著 降解，使黃原膠的有序結(jié)構(gòu)向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而有 利于反應(yīng)物的滲入，使反應(yīng)更易進(jìn)行。

2.2.23-氯-2-羥基丙磺酸鈉用量對磺化產(chǎn)物硫酸

基含量的影響 

量，所得的磺化試劑的用量對磺化產(chǎn)物硫酸基含量 的影響如圖2

 

增大3-氯-2-羥基丙磺酸鈉的用量，整個反應(yīng)向 著有利于生成物的方向進(jìn)行，磺化產(chǎn)物的硫酸基含 量增加，產(chǎn)物的溶解性能也有所增強。

2.2.3反應(yīng)時間對產(chǎn)物硫酸基含量的影響

固定降解黃原膠用量為1 g反應(yīng)溫度定為60 C 3-氯-2-羥基丙磺酸鈉的用量為8 g逐步延長反 應(yīng)時間，考察反應(yīng)時間對磺化產(chǎn)物硫酸基含量的影 響如表2。

表2反應(yīng)時間對磺化產(chǎn)物硫酸基含量的影響

Reaction tim e/ hSO2-/%

215. 53

2.517. 63

320. 47

3. 521. 80

423.58

由表2可見，延長磺化反應(yīng)的時間能增加產(chǎn)物 的磺酸基含量，而且反應(yīng)3 h后硫酸基含量趨于穩(wěn) 定，所以將反應(yīng)的時間定為3 h。

2.2.4降解黃原膠磺化衍生物的紅外表征

FT IR譜（圖3)中的3450 cm^處有吸收峰，顯 示有-OH基團(tuán)的O-H鍵;2805 cm^處有吸收峰，顯 示有-CH2或-CH3基團(tuán)的C-H鍵伸縮振動;在1022 cm^處的吸收峰是C-O-C (糖環(huán)）的伸縮振動，在 1637 cm^附近有-COO-的特征峰，由反對稱COO- 伸縮振動引起，圖4中的磺化降解黃原膠在1268cm 1處的吸收峰，證明有-OSO3的S=O伸縮振 動:在830 cm^的吸收峰，顯示有C-O-S鍵的伸縮 振動。紅外光譜表明降解黃原膠與3-氯-2-羥基丙 磺酸鈉發(fā)生了磺化反應(yīng)，獲得了黃原膠磺化衍生物。 2.3凈化體系pH值和降解黃原膠磺化衍生物濃 度對血漿凈化效果的影響

影響LDL誘導(dǎo)沉淀的主要因素包括凈化劑濃 度和體系pH值。下面將分別考察兩者對血漿凈化 效果的影響。

2.3.1降解黃原膠磺化衍生物濃度對血漿脂蛋白 凈化效果的影響

用含有不同濃度的降解黃原膠磺化衍生物的緩 沖溶液，按1 : 1體積比與已去除血細(xì)胞的血漿混合 進(jìn)行凈化，考察凈化劑濃度（PA)對血漿脂蛋白的凈 化效果。圖5顯示出體系pH = 5. 10時，血漿脂蛋 白凈化效果隨降解黃原膠磺化衍生物濃度的變化關(guān) 系。

 

圖5凈化劑濃度對血漿誘導(dǎo)沉淀凈化效果的影響(n= 5) 實驗中觀察到，在一定pH壞境下，隨凈化劑濃 度增大，血漿TC及LDL凈化率均有所增加。在體 系pH = 5. 10時，隨著凈化劑濃度的增大至2500 mg/L，可使TC下降47%左右，LDL和VLDL下降 55%左右，而對HDL的清除率在23%左右。這是 由于LDL和HDL的載脂蛋白的種類、組成及空間 結(jié)構(gòu)存在較大差異所致。LDL的載脂蛋白為 apolipoprotein-B，其富含賴氨酸、精氨酸和組氨酸 等堿性氨基酸殘基，且多暴露于載脂蛋白表面。而 HDL的載脂蛋白為apolipoprotein-A，亦含有一定 量的賴氨酸，但其暴露在HDL分子表面的比率較 小。HDL等電點低于LDL，故在相同pH環(huán)境下， HDL所帶的正電荷比LDL少。當(dāng)體系pH = 5. 10 近似于LDL的等娜，可以促使LDL聚沉。另外，LDL的相對分子質(zhì)量及尺寸均較HDL大，在等 電點處更容易聚集。

此外，F(xiàn)ib是一種纖維狀蛋白質(zhì)高分子，其等點 電約為pH = 5.5。當(dāng)體系pH值低于其等電點時， Fib整體帶正電荷，容易與聚陰離子形成復(fù)合物絮 凝沉淀出來。通過實驗發(fā)現(xiàn)，體系pH =5.10時，當(dāng) 凈化劑溶度達(dá)到1500 mg/L時，在所取上清液中加 入適量的亞硫酸鈉溶液均沒有形成沉淀，磺酸基降解黃原膠選擇性清除血漿的研究,表明此時 Fib的清除率接近100%。

同球型LDL分子相比，F(xiàn)ib具有特殊的纖維狀 結(jié)構(gòu)，并且其等電點高于LDL的等電點，因此，在相 同pH環(huán)境下，F(xiàn)ib所帶的正電荷比LDL多，其與聚 陰離子形成不溶性復(fù)合物的能力較LDL更強。 2.3.2凈化體系pH值對血漿脂蛋白凈化效果的 影響

凈化體系pH值影響凈化劑誘導(dǎo)沉淀LDL及 Fib的另一個重要因素，在凈化劑濃度一定的條件 下，改變凈化體系的pH值，考察其對血液凈化效果 的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6凈化體系pH值對血漿脂蛋白凈化 效果的影響(n= 5)

由圖6可得：隨著pH下降，TC、LDL及HDL

的清除率均將提高。這是由于體系pH環(huán)境決定了 血漿蛋白質(zhì)的荷電數(shù)，故對蛋白質(zhì)與凈化劑相互作 用有重要的影響。而TP變化并不顯著。在pH低 于5. 1后的Fib的清除率較高，所以選取pH = 5.10 作為凈化的優(yōu)化pH值，在此體系下能較大程度得 清除TC、LDL、Fib，而對TP及HDL的影響較小。 2.3.3凈化效果測定

配制一定量的凈化劑，使其濃度為2500 mg/L， 在pH = 5. 10的凈化體系下，對12個血漿樣本進(jìn)行 凈化實驗，凈化結(jié)果如表3所示。 

表312個血漿樣本脂蛋白凈化效果

CpA/mg。L—1CB/mg ° L —1CB/ g ° L-1CA/mg • L-1CA/g • L-1RP/%

TC HDL LDLFib TPTC HDL LDLFib TPTCHD LLDLFibTP

2500925 ±41 327±6 598±337. 9±0.8 81. 2±3.1508±17 248±11 261±190±0 56. 8±2.445245510030

 

[9]

本文中首先介紹用黃原膠作為載體，并以3-氯-2-羥

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3結(jié)論

1)以黃原膠為原料，首先進(jìn)行酸降解再以3- 氯-2-羥基丙磺酸鈉為磺化試劑，對其進(jìn)行磺化，可 以獲得降解黃原膠磺化衍生物。通過實驗磺化反應(yīng) 的較優(yōu)條件為：取1 g降解黃原膠，反應(yīng)溫度為60 C磺化試劑3-氯-2-羥基丙磺酸鈉的用量為8 g反 應(yīng)時間為3 h。在此條件下產(chǎn)物硫酸基含量有 23.58%。紅外光譜分析表明，該衍生物為新型酸性 粘多糖，是一種新型類肝素物質(zhì)。

2)以這種新型降解黃原膠磺化衍生物為凈化 劑，研究其選擇凈化血液低密度脂蛋白（LDL)及纖 維蛋白原(Fib)的性能，得到較優(yōu)凈化條件為：在體 系pH= 5. 10,凈化劑濃度為2500 mg/ L時，可使 TC下降45 %左右，LDL和VLDL下降55%，F(xiàn)ib 清除率接近100%，而對HDL和TP的凈化率為 24%和30%，說明該降解黃原膠磺化衍生物具有良 好的選擇凈化性能，是一種新型LDL/Fib凈化劑。

利用多糖物質(zhì)來替代肝素，從而制備出一種類 肝素低密度脂蛋白凈化劑，磺酸基降解黃原膠選擇性清除血漿的研究,它具有成本低，制備過程 容易等優(yōu)點。同時，在同類低密度脂蛋白凈化劑中， 基丙磺酸鈉代替常規(guī)的氯磺酸作為磺化試劑，這樣也使磺化反應(yīng)過程相對比較溫和。同時，根據(jù)上述血液凈化的實驗數(shù)據(jù)，可以證明其對于降低血漿中低密度脂蛋白和纖維蛋白原有良好的效果，是一種可行的選擇性清除血漿LDL/Fib凈化劑。