黃原膠（Xanthan gum)亦稱黃單胞多糖，是由甘藍(lán)黑腐病黃單胞桿菌 (決owowos )或其他黃單胞桿菌屬的菌株以碳水化合物為主要原料經(jīng)

發(fā)酵產(chǎn)生的高分子酸性胞外雜多糖，其生物合成機(jī)制為“非模板合成機(jī)制” [1]。

黃原膠分子是由“五糖重復(fù)單元”結(jié)構(gòu)聚合體[2]，黃原膠分子彼此間靠氫鍵形成 雙股的二級(jí)螺旋立體結(jié)構(gòu)[3]；雙股螺旋結(jié)構(gòu)間靠微弱的非共價(jià)鍵結(jié)合，排列成整齊的 “超級(jí)接合帶狀”的三級(jí)螺旋聚合結(jié)構(gòu)[4]；在極稀（<1 %)的水溶液中，不加熱時(shí)黃 原膠呈現(xiàn)典型的四級(jí)菊花狀聚集結(jié)構(gòu)[5]。

王德潤(rùn)等利用透射電鏡實(shí)驗(yàn)觀察了單個(gè)黃原膠分子形貌，從而證明黃原膠分子 由40余個(gè)亞基組成了右手雙螺旋結(jié)構(gòu)[5]，隨后又用GPC方法研究了黃原膠水溶液中 的構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)在締合態(tài)和分子態(tài)之間存在動(dòng)態(tài)平衡，締合態(tài)為多分子分段兩兩締合呈 右旋雙螺旋構(gòu)象[6]。趙大健等用特性粘度法算得黃原膠的相對(duì)分子質(zhì)量是2.41405 g/mol [7]，王德潤(rùn)等利用透射電鏡的實(shí)驗(yàn)方法，計(jì)算出黃原膠的相對(duì)分子質(zhì)量是6x106 g/mol?25^106 g/mol [5]，用光散射法測(cè)定的黃原膠的相對(duì)分子質(zhì)量是2.36x106 g/mol [6]。趙大鍵等利用超聲波切斷技術(shù)處理天然黃原膠，得到一系列分子量不同的試樣， 經(jīng)小角度激光散射法（SALLS)測(cè)得黃原膠相對(duì)分子質(zhì)量，以其為作為標(biāo)樣，用GPC 法測(cè)得了天然黃原膠的相對(duì)分子質(zhì)量和其對(duì)應(yīng)的分子量分布[8]。黃原膠的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn) 圖1.1。

 

n

O

圖1.1黃原膠的分子結(jié)構(gòu) Fig.1.1 molecular structure of Xanthan gum

1.2黃原膠的生物合成

現(xiàn)已有多位研究人員Coplin和Leigh等對(duì)黃原膠的微生物合成途徑進(jìn)行了闡述。 如圖1.2所示，黃原膠的合成，從五元糖重復(fù)單元結(jié)構(gòu)的裝配開(kāi)始，然后將這些重復(fù) 單元結(jié)構(gòu)聚合生成大分子。五元糖裝配的第一步是UDP-葡萄糖上1-磷酸糖基轉(zhuǎn)移到 多萜磷酸鹽上然后再逐個(gè)按序?qū)⑵渌菤埢D(zhuǎn)移上去，D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸分 別來(lái)自GDP-甘露糖和UDP-葡萄糖醛酸，從而得到完整的與脂相連接的五元糖重復(fù)單 元，并且黃原膠鏈的增長(zhǎng)發(fā)生在還原末端。生物合成的最后一步，是將黃原膠從細(xì) 胞膜上分泌出去。穿過(guò)周質(zhì)和外膜分泌到胞外環(huán)境的過(guò)程還沒(méi)有得到完全的闡述。 這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程需要能量，并且可能是通過(guò)一個(gè)特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)保證將 高聚物從脂類載體上釋放出來(lái)并且進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在野油菜黃單胞桿菌野油菜致病 變種決owowas1 ca—es/r/s pv.中，Vanderslice和Vojnov指出黃原膠

的生物合成分別有12個(gè)不同的基因組成的基因簇（從即mB到即mM)相互協(xié)調(diào)指導(dǎo)。 現(xiàn)今參與黃原膠合成的許多基因已經(jīng)被鑒定、分離和表征[9]。

2 

 

圖1.2黃原膠生物合成示意圖 Fig.1.2Xj3inthan gum biosynthesis diagram

3

 

1.3黃原膠發(fā)酵工藝的研究

1.3.1菌種對(duì)黃原膠發(fā)酵質(zhì)量的影響

黃原膠發(fā)酵的菌種一般采用野油菜黃單胞桿菌，此類菌株一般呈桿狀，產(chǎn)莢膜， 有極性鞭毛，無(wú)芽抱，專性好氧，革蘭氏染色陰性菌[10]。

現(xiàn)如今生物技術(shù)的迅速發(fā)展，可以通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)培育菌種，它將目的基 因通過(guò)一定的生物技術(shù)方式導(dǎo)入受菌體內(nèi)，然后篩選出能夠表達(dá)目的基因的菌株[11]。 Pollock等[12]將與黃原膠相關(guān)的乙?；?、丙酮酸、多聚體等目的基因?qū)氩煌N屬的 黃原膠生產(chǎn)菌中實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示所生成的黃原膠特性與原菌株產(chǎn)生的黃原膠基本相 同。Chou等[13]認(rèn)為即mD基因與菌株色素合成有關(guān)，如能切除該基因，則可得到無(wú) 色黃原膠。姚仕儀等[14]通過(guò)構(gòu)建一株基因工程菌又CC見(jiàn)409275,研究了野油菜黃單 胞菌重組克隆尸/^9275對(duì)黃原膠合成的影響，結(jié)果顯示黃原膠產(chǎn)量比親本增加了 7.14%。

1.3.2碳源/氮源（C/N)對(duì)黃原膠發(fā)酵質(zhì)量的影響

張禹等研究發(fā)現(xiàn)C/N對(duì)發(fā)酵速度、發(fā)酵周期有重要的影響，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始， 采用較高的C/N (大約50: 1)促進(jìn)黃原膠的合成。同一批黃原膠發(fā)酵周期的延長(zhǎng)， 丙酮酸含量不斷的增加。因此，C/N通過(guò)控制生長(zhǎng)速度將其作用傳遞給丙酮酸的合 成[15]。

I.W.sutherland研究認(rèn)為，對(duì)于好氣菌來(lái)說(shuō)，高氧量和低C/N比值促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)， 相對(duì)低的氧量和高C/N比值則利于胞外多糖合成。Garcia-Ochoa、Schweickart和

Quinlan也普遍認(rèn)為較高的氮源濃度對(duì)于較快的微生物生長(zhǎng)和較高的微生物濃度是有 利的[16]，然而較高的碳源濃度對(duì)于黃原膠的合成更加有利。

基于黃原膠發(fā)酵過(guò)程中微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成不同階段對(duì)C/N需求不同， Yang-Ming Lo將G/YE (葡萄糖/酵母浸粉）的兩階段發(fā)酵工藝應(yīng)用于黃原膠發(fā)酵過(guò) 程中：發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)利用較低的G/YE (2.5%/0.3%)，當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束的時(shí)候一次 添加額外的葡萄糖（2.5%)，從而創(chuàng)造一個(gè)較高的G/YE環(huán)境，發(fā)酵所得的黃原膠質(zhì) 量與間歇發(fā)酵G/YE (5.0%/0.3%)和半連續(xù)發(fā)酵（發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)利用較低的G/YE (2.5%/0.3%)，當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束的時(shí)候，額外的葡萄糖（2.5%)是在穩(wěn)定期內(nèi)分

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五次留加完成的，每次間隔五小時(shí)）相比，兩階段發(fā)酵都優(yōu)于間歇發(fā)酵和半連續(xù)發(fā) 酵[17]。

這樣不論是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期還是在穩(wěn)定期都分別創(chuàng)造了合適的微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)膠 環(huán)境，發(fā)酵過(guò)程中分別出現(xiàn)了較快的微生物生長(zhǎng)和較高的黃原膠產(chǎn)率，同時(shí) Yang-Ming Lo為了確定是否僅有G/YE是影響發(fā)酵的重要因素還是是否酵母浸粉的 濃度也是局定因素。另外一個(gè)兩階段試驗(yàn)：培養(yǎng)基中G/YE是1.5%/0.18%，但是G/YE 與G/YE為2.5%/0.3%是相同的。當(dāng)微生物進(jìn)入穩(wěn)定期以后，一次性流加額外的3.5% 的葡萄糖從而為發(fā)酵環(huán)境創(chuàng)造一個(gè)較高的G/YE (5.0%/0.18%)。結(jié)果顯示菌體生長(zhǎng) 速率和黃原膠產(chǎn)率與較高濃度時(shí)的酵母浸粉發(fā)酵相比都要低，較低的黃原膠產(chǎn)率是 由于進(jìn)入穩(wěn)定期后較低的菌體濃度造成的。很明顯，單獨(dú)的G/YE并不能決定黃原膠 發(fā)酵，也需要培養(yǎng)基中酵母浸粉濃度保持在一個(gè)合適的水平[17]。

1.3.3無(wú)機(jī)鹽對(duì)黃原膠發(fā)酵質(zhì)量的影響

丙酮酸含量是黃原膠產(chǎn)品的一項(xiàng)重要質(zhì)量指標(biāo)。丙酮酸含量越高，黃原膠的性 能越好。張禹等研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)機(jī)鹽對(duì)黃原膠中的丙酮酸含量有不同程度的影響。當(dāng) 限制了 Ca2+或NH4+的濃度時(shí)，丙酮酸含量降低幅度較少，當(dāng)限制K+或Mg2+濃度時(shí)， 丙酮酸含量有明顯下降，當(dāng)限制Fe3+濃度時(shí)，丙酮酸含量得到提高[17]。張國(guó)佩等研 究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)奈⒘吭?，特別是適宜的元素組合對(duì)黃原膠菌種的生長(zhǎng)代謝、多糖 積累有明顯的促進(jìn)作用，綜合比較Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、B5+六種元素的 組合對(duì)黃原膠的合成效果最好[18]。

I.W.Sutherland在闡述微生物胞外多糖的生物合成時(shí)指出，微生物胞外多糖分子 結(jié)構(gòu)中的丙酮酸是在多糖“重復(fù)單元”在細(xì)胞膜內(nèi)C55-Lipid-P糖基載體脂上合成時(shí) 組入的。磷酸烯醇式丙酮酸既是菌體細(xì)胞有氧呼吸產(chǎn)生的ATP的重要中間物質(zhì)，又是 為微生物胞外多糖提供丙酮酸非糖基組分的供體[1,19]。刁虎欣等人的研究表明，經(jīng)正 交試驗(yàn)選擇的最佳搖瓶發(fā)酵條件，結(jié)果表明，碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和通氣量皆是影 響黃原膠丙酮酸的含量的極顯著因素。其中氮源和通氣量又是這四種極顯著因素中 的最顯著因素[20]。這與I.W.Sutherland報(bào)道的氮源和通氣量是影響微生物胞外丙酮酸 含量的結(jié)果一致[19]。組成的產(chǎn)生高丙酮酸含量黃原膠的最佳發(fā)酵條件是：蔗糖2%、 玉米淀粉2%、豆餅粉0.5%、K2HPO40.5%、MgSO4*7H2O 0.02%，pH 7.0，自來(lái)水配 制，接種量2%，搖床轉(zhuǎn)速240 r/min[20]。

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趙潤(rùn)寶等人在發(fā)酵過(guò)程中添加游離丙酮酸研究顯示：明顯提高了所產(chǎn)黃原膠分 子中的丙酮酸功能基團(tuán)的含量，添加3.0 g/L的游離丙酮酸可以使黃原膠分子中丙酮 酸功能基團(tuán)的含量有4.74%提高到了 5.29%，提高11.6%，且不影響黃原膠的產(chǎn)膠率， 達(dá)到33.9 g/L。同時(shí)指出游離丙酮酸最佳的添加時(shí)間為發(fā)酵開(kāi)始后24 h[21]。

I.W.Sutherland在綜述微生物胞外多糖生物合成和調(diào)控時(shí)指出，依賴于 C55-Lipid-P糖基載體脂的微生物胞外多糖合成，其分子鏈長(zhǎng)度與C55-Lipid-P運(yùn)載糖 基的效率有關(guān)。微生物細(xì)胞生長(zhǎng)速度越慢，C55-Lipid-P運(yùn)載糖基效率越高，多糖的 聚合度越高[1]。輕質(zhì)CaCO3是最佳的無(wú)機(jī)鹽，輕質(zhì)CaCO3的生理功能，既可作為緩 沖劑，調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的pH，控制細(xì)胞的生長(zhǎng)，其解離出的極少量Ca2+也可能作為 聚合酶的促進(jìn)因子，提高聚合酶的活性，提高黃原膠的聚合度，提高黃原膠的分子 量降]。

1.3.4攪拌速度和溶氧對(duì)黃原膠質(zhì)量的影響

由于黃原發(fā)酵液流變學(xué)的復(fù)雜性，攪拌速度影響的不僅是發(fā)酵液的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)還 有氧的傳質(zhì)速率，攪拌作用包含對(duì)溶液的剪切稀化和空氣的作用，兩者是相互作用 的。在黃原膠發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行胞外多糖的不斷積累，導(dǎo)致發(fā)酵液的粘 度也來(lái)越大，因此，把溶氧分成兩個(gè)階段：（1)氣液的混合；（2)溶解于液體中的氧 穿透胞外多糖順利運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。

Flores, Suh曾報(bào)道黃原膠質(zhì)量受到氧攝入比速率的顯著影響，Amanullah認(rèn)為氧 攝入比速率的變化依賴混合的程度。因此，當(dāng)黃原膠的濃度超過(guò)20 g/L時(shí)，在較低 的攪拌速率下，可能會(huì)產(chǎn)生相對(duì)差的混合，從而導(dǎo)致較差的黃原膠質(zhì)量，因此攪拌 對(duì)于黃原膠質(zhì)量的提高起著至關(guān)重要的作用[23]。Moraine和Rogovin，Kennedy以及 Funahashi認(rèn)為這是由于黃單胞桿菌周?chē)舛嗵堑牟粩喾e累，增加了氧氣和其他營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)淖枇?，?dāng)增加攪拌速度的時(shí)候產(chǎn)生的有利作用的原因是：使胞外的多 糖層變薄，從而提高了黃原膠形成所必需的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸[24]。然而，Perters 提出：第一，胞外多糖層并不存在，第二，溶氧限制可以被避免（增加轉(zhuǎn)速或者利 用純氧代替部分空氣），黃原膠生成比速率并沒(méi)有受到攪拌速度和剪切力的影響。這 里需要重要指出的是上述實(shí)驗(yàn)的黃原膠產(chǎn)率最終沒(méi)有超過(guò)16 g/L，并且，發(fā)酵液中 并沒(méi)有靜止區(qū)的出現(xiàn)[25]。

M. Papagianni利用實(shí)驗(yàn)室2L的發(fā)酵罐，在pH沒(méi)有控制的前提下，對(duì)黃單胞

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桿菌dTUC 1395的黃原膠間歇生產(chǎn)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)酵分別在不同的的 攬拌轉(zhuǎn)速（100 r/min、200 r/min、300 r/min、400 r/min、600 r/min)下發(fā)酵，保證在 72 h在速度100 r/min的時(shí)候不低于飽和度的5%，同時(shí)在600 r/min時(shí)不低于飽和度 的10%。結(jié)果顯示攪拌轉(zhuǎn)速在600 r/min時(shí)，與轉(zhuǎn)速在200 r/min時(shí)相比，黃原膠產(chǎn) 量和菌體濃度幾乎分別增加兩倍，并將胞外多糖中的丙酮酸和其分子量關(guān)聯(lián)起來(lái)。 黃原膠有效的生成是在600 r/min，在這個(gè)速度下，能保證一個(gè)較好的溶氧[2]。這些 與作者前期的研究一致：要想獲得較高的產(chǎn)量，較高的溶氧是必需的。Amanullah在 其研究中也闡述道，當(dāng)黃原膠濃度達(dá)到20 g/L時(shí)，微生物的氧攝入速率更快，所以 攪拌轉(zhuǎn)速為1000 r/min時(shí)（與轉(zhuǎn)速為500 r/min相比），黃原膠的產(chǎn)量增加。生物量 隨著攪拌速度的增加而增加，然而在Amanullah的報(bào)道中當(dāng)攪拌速度500 r/min與 1000 r/min相比，并沒(méi)有引起生物量的變化[23]。

在不同的生長(zhǎng)階段，產(chǎn)生的黃原膠分子的分子量和取代程度是不同的，因此， 發(fā)酵結(jié)束后所得到的黃原膠是不同結(jié)構(gòu)分子的混合物。

Peters利用15 L機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器在不同攪拌速度（200 r/min?800 r/min) 下實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在較低的攪拌速率下，溶氧限制較早的出現(xiàn)，發(fā)酵生產(chǎn)出的黃原膠的 平均分子量（Mw)也會(huì)越低[25]。

I.S.Suh利用鼓泡柱（Suh和Pons指出鼓泡柱具有良好混合性，不存在停滯區(qū)）， 利用不同的通氣速率（U〇=0.051m/s、0.100 m/s、0.165 m/s、0.361 m/s):黃原膠分

子量的大小受氧傳遞速率限制的影響較大，有時(shí)與其呈線性關(guān)系，不同通氣速率下 分別發(fā)酵，最初的黃原膠平均分子質(zhì)量相差很大，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)（30 h)平 均分子質(zhì)量迅速的增加到相似的最大值（8.8x106 g/mol?9.4x106 g/mol)，黃原膠的 濃度僅為6.7 g/L。進(jìn)入穩(wěn)定期后，黃原膠平均分子質(zhì)量下降，下降的速率與通氣速 率有顯著的關(guān)系（通氣速率較低條件下發(fā)酵所得黃原膠平均分子質(zhì)量與通氣速率較 高條件下發(fā)酵所的黃原膠平均分子質(zhì)量相比，前者進(jìn)入穩(wěn)定期后，下降更為迅速）， 其研究還顯示，在較低的通氣速率下（UG =0.051 m/s)時(shí)，分別在t=30 h和t=154 h 所得黃原膠分子量分布表明：t=30 h (對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期剛結(jié)束時(shí)）所得黃原膠離散度比 t=154 h所得黃原膠離散度要小，并且前者所得黃原膠分子量在7x106 g/mol?4x107 g/mol中所占的含量比后者多[26]。

II-Soon Suh 研究表明在 Synthentic (BC-4)和 Complex (BC-3)不同發(fā)酵培養(yǎng)

基中發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束前，BC-3培養(yǎng)基發(fā)酵所得的黃原膠平均分子質(zhì)量明

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顯優(yōu)于BC-4培養(yǎng)基發(fā)酵所的黃原膠平均分子質(zhì)量，但進(jìn)入穩(wěn)定期后，BC-3培養(yǎng)基 發(fā)酵所得的黃原膠平均分子質(zhì)量急劇的下降，質(zhì)量明顯不如BC-4培養(yǎng)基發(fā)酵所得的 黃原膠平均分子質(zhì)量，其原因是由于其不必要的高生物量致使對(duì)溶氧的需求得不到 滿足，不僅使黃原膠的產(chǎn)量下降，更正要的是導(dǎo)致黃原膠質(zhì)量的下降[27]。

對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黃原膠平均分子質(zhì)量達(dá)到最大值，其后隨著發(fā)酵 進(jìn)入穩(wěn)定期，黃原膠平均分子質(zhì)量下降，本文作者究其原因：牛淑敏研究發(fā)現(xiàn)最先 分泌黃原膠的都源于菌體的端部，這可能是由于這個(gè)部位是新生壁，比較薄的緣故 [28]。這段期間，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶氧在沒(méi)有胞外多糖的積累的環(huán)境中的運(yùn)輸相對(duì)較易， 聚合酶使的黃原膠的主鏈不斷的增長(zhǎng)，此時(shí)黃原膠平均分子量達(dá)到最大值，隨著發(fā) 酵的進(jìn)行，牛淑敏也觀察到，細(xì)胞的周?chē)_(kāi)始不斷的大量分泌黃原膠[28]，隨著胞外 多糖的積累，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶氧的運(yùn)輸阻力增大，主鏈增長(zhǎng)的速度減緩，從而導(dǎo)致黃 原膠平均分子質(zhì)量下降。

Fernado Flores在2 L的機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器內(nèi)研究結(jié)果表明：雖然影響黃原 膠生物合成機(jī)理尚不清楚，但是發(fā)酵液中高的溶氧濃度有利于黃原膠分子的聚合時(shí) 非常明顯的。發(fā)酵液中的溶氧濃度還會(huì)影響到黃原膠的產(chǎn)率及其平均分子量和分子 量分布[30]。相同實(shí)驗(yàn)證明，溶氧濃度越高其黃原膠的生物合成開(kāi)始的越早，而黃原 膠生成的停止通常是由于培養(yǎng)基中碳源的耗盡造成的，從某種意義上講，高濃度黃 原膠發(fā)酵液的得到必須有較高的溶氧濃度為前提的[29]。

用HPLC測(cè)得的黃原膠分子量顯示不受攪拌速度增加（100 r/min和600 r/min) 而受到影響，在這兩組實(shí)驗(yàn)中，黃原膠的分子量都在5x105 g/mol左右[2]，但需要指 出的是600 r/min發(fā)酵結(jié)束時(shí)其黃原膠最終產(chǎn)量?jī)H為6.3 g/L。

分子量并不僅僅是決定黃原膠質(zhì)量的參數(shù)，盡管它在研究中是首先考慮的。丙 酮酸含量對(duì)其特定的應(yīng)用具有更重要的影響作用[31]。M.Papagianni研究表明在發(fā)酵 的72小時(shí)，黃單胞桿菌發(fā)酵合成黃原膠的工程基礎(chǔ)研究，對(duì)于不同攪拌速度（100 r/min?600 r/min)下，利用HPLC對(duì)其丙酮含 量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其隨著攪拌速度的提高而增加，眾所周知，丙酮酸含量主要依賴菌株 和培養(yǎng)基的選擇[2]。Peters提出了微生物對(duì)氧的需求和丙酮酸含量?jī)烧咧g存在著直 接的聯(lián)系。較高的速度將會(huì)提高溶氧水平，而丙酮酸依賴氧的供給，從而解釋了在 較高的攪拌轉(zhuǎn)速下得到較高的丙酮酸含量[25]。  

1.4黃原膠發(fā)酵工程的研究

姚恕、李衛(wèi)旗[32]通過(guò)對(duì)黃原膠在不同發(fā)酵罐的實(shí)驗(yàn)，闡述了發(fā)酵罐的罐體高徑 比、攪拌器、槳葉直徑與擋板、通氣量及加熱系統(tǒng)控制等因素對(duì)發(fā)酵的影響。

1.4.1不同攪拌體系對(duì)黃原膠發(fā)酵質(zhì)量的影響

Peters等利用三層Inter-Mig槳攪拌對(duì)黃原膠發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速低于6.67 s-1時(shí)，

會(huì)發(fā)生發(fā)酵液供氧不足的現(xiàn)象，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時(shí)黃原膠的產(chǎn)量和黃原膠平均分子量 有很大程度的下降；若保持總氣量不變，通過(guò)通入部分純氧代替先前的部分空氣， 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不僅發(fā)酵液中的溶氧水平明顯增加，更重要的是黃原膠的濃度 有了顯著的提高，因此在黃原膠發(fā)酵的中后期，溶氧是影響黃原膠產(chǎn)量和質(zhì)量的重 要因素。

本實(shí)驗(yàn)室苗偉等對(duì)兩層組合槳在黃原膠水溶液中的混合性能進(jìn)行了較詳細(xì)的系 統(tǒng)研究，通過(guò)氣含率、容積傳氧系數(shù)和功耗這三個(gè)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)和分析，對(duì)各種組合 槳之間進(jìn)行了比較。得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：上層的雙折葉下壓圓盤(pán)渦輪和下層的凹 葉圓盤(pán)渦輪組合具有低能耗、高氣含率的特性；上層的雙折葉圓盤(pán)渦輪和下層的六 葉布魯馬金組合槳有利于獲得高的容積傳氧系數(shù)；因而在高濃度的黃原膠溶液中， 底層槳加大直徑可獲得較高的氣含率，有利于非牛頓流體中氣液傳質(zhì)和混合[33]。

1.4.2氣體分布器對(duì)黃原膠發(fā)酵質(zhì)量的影響

在傳統(tǒng)氣體分布器的基礎(chǔ)上，改進(jìn)的氣體分布器不僅使分散出的氣體盡可能小， 延長(zhǎng)氣體在發(fā)酵液中的滯留時(shí)間，同時(shí)加大了氣液接觸面積，從而增加溶氧推動(dòng)力。

張炎等發(fā)現(xiàn)在氣液混合反應(yīng)的過(guò)程中，氣泡直徑的大小往往對(duì)最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 起了決定性的作用。減小從氣體分布器出來(lái)后的氣體的直徑，促進(jìn)氣液間的傳遞，從 而加快反應(yīng)的進(jìn)程。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)在氣液攪拌式反應(yīng)器上安裝了一種特殊的 氣體分布器，通過(guò)攪拌產(chǎn)生離心場(chǎng)，從而誘導(dǎo)生成泰勒渦柱。從而減少了氣泡間的凝 并作用，氣泡尺寸減小，與對(duì)照組相比，反應(yīng)器中最小的氣泡尺寸減小了近50%，氣泡 的比表面積增加近80%。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)比較，在使用特殊氣體分布器的反應(yīng)器中，氧的 傳遞系數(shù)增加了 10%?40%，證明這種氣體分布器確實(shí)可以增加氣液間氧的傳遞[34]。  

洪厚勝等[35]設(shè)計(jì)了一種新型氣升環(huán)流反應(yīng)器，其研究結(jié)果表明：新型氣升環(huán)流 反應(yīng)器比機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐更適合于高粘度培養(yǎng)物的發(fā)酵。

1.4.3擋板對(duì)黃原膠發(fā)酵質(zhì)量的影響

本實(shí)驗(yàn)室盛春琦通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中有無(wú)擋板以及窄擋板的研究發(fā)現(xiàn)：隨著發(fā)酵 的進(jìn)行，特別是到了發(fā)酵的中后期，發(fā)酵液中出現(xiàn)了停滯區(qū)，致使停滯區(qū)中溶氧和 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸阻力加大，不僅導(dǎo)致黃原膠產(chǎn)量下降，更重要的是導(dǎo)致黃原膠分子量 的下降以及丙酮酸含量的降低，這一研究結(jié)果與李衛(wèi)旗等研究的在傳統(tǒng)平葉攪拌器 發(fā)酵設(shè)備中，適當(dāng)減小擋板數(shù)目或不設(shè)擋板更有利于黃原膠高粘性物系發(fā)酵的研究 結(jié)果一致[36]。

1.5黃原膠分離提取 1.5.1發(fā)酵液的預(yù)處理

該工序主要是去除菌體細(xì)胞和各種不溶性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量和色 澤。預(yù)處理的方法有很多，主要有離心法、硅藻土過(guò)濾法、酶處理法、次氯酸鹽氧化法、 亞硫酸鈉漂白法、超濾、減壓蒸餾等。其中硅藻土過(guò)濾法除雜質(zhì)的效果較好，因?yàn)楣?藻土有較小的顆粒度、較大的比表面和表觀能，表面呈多孔狀，極易吸附溶液中較小的 固體顆粒，經(jīng)過(guò)濾處理，就能使菌體雜質(zhì)與硅藻土一起除去。實(shí)驗(yàn)證明：硅藻土過(guò)濾法 對(duì)去除菌體有顯著效果。但回收率低，最佳過(guò)濾條件為發(fā)酵液等倍稀釋，硅藻土用量為 原發(fā)酵液的0.1%[37]。用蛋白酶和溶菌酶對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行降解，可除去菌體殘骸等蛋白質(zhì) 不溶物。這種方法使所得的黃原膠具有較好的粘度和透光度。此提純工序可以減少稀 釋、抽濾、離心分離這些復(fù)雜的步驟，最重要的是能提高產(chǎn)品的純度。

1.5.2黃原膠的提取

根據(jù)黃原膠的提取程序的不同，可分為粗制和精制兩種，而精制品又分為工業(yè)級(jí)和 食品級(jí)。它們的提取方法不同，粗制品可用直接干燥法提取，此法會(huì)使黃原膠含有大量 的菌體殘骸等固體不溶物，因而使其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用受到影響。精致品的提取方法有多 種，主要有有機(jī)溶劑（乙醇、異丙醇、甲醇）沉淀法、無(wú)機(jī)陽(yáng)離子鈣鹽沉淀法、鋁鹽沉

10

淀法、酸沉淀法、有機(jī)陽(yáng)離子季銨鹽沉淀法以及藥處理方法等，在這些方法中，尤以乙 醇沉淀法、鈣鹽一乙醇沉淀法效果較好。

1.5.2.1乙醇沉淀法[37]

乙醇和發(fā)酵液混合，當(dāng)混合液中乙醇的濃度超過(guò)50%時(shí)，黃原膠能以纖維狀沉淀的 形式由混合液中提取出來(lái)。其原理為：低級(jí)醇的加入能降低黃原膠分子與水溶液間的 親和力，使它變?yōu)辄S原膠分子間親和力。在較高的醇濃度下，使之相互結(jié)合凝結(jié)而形成 沉淀。在以低級(jí)醇沉淀黃原膠的過(guò)程中，還可部分的洗脫掉發(fā)酵液中的色素，外源鹽類 及菌體細(xì)胞。淄博中軒集團(tuán)已建成年產(chǎn)15000噸的食品級(jí)的黃原膠的生產(chǎn)線。其提取 路線為：

發(fā)酵液乙醇沉淀一乙醇洗滌脫色一-擠壓一-打散——真空干

燥11

I —回收乙醇返回

11

—回收乙醇—粉碎——包裝—成品

研究表明，黃原膠溶液中加入Na+、K+等陽(yáng)離子也節(jié)省醇的用量。當(dāng)KCI的濃度在

0.2%?1%之間時(shí)，隨KCI濃度的增高，醇的用量降低;控制pH為5.5時(shí)，乙醇的加入量 只需為發(fā)酵液超濾濃縮后的體積的1.2倍，乙醇用量減少。

1.5.2.2鈣鹽沉淀法

在堿性條件下，鈣離子能與黃原膠形成黃原膠鈣鹽復(fù)合物沉淀。該復(fù)合物沉淀經(jīng)酸 性醇沉淀處理，可使鈣離子解離，將黃原膠鈣鹽復(fù)合物沉淀轉(zhuǎn)變?yōu)辄S原膠的醇沉淀。常 見(jiàn)的鈣鹽有氯化鈣、氫氧化鈣、氯化鎂等。具體操作為：在發(fā)酵液中加入氯化鈣和氫 氧化鈉，充分?jǐn)嚢枋剐纬牲S原膠鈣鹽復(fù)合物葉凝膠狀沉淀，過(guò)濾脫水后加入酒精、鹽酸 洗滌沉淀，過(guò)濾后再加入少許酒精洗脫、干燥。

1.5.3沉淀物的烘干

經(jīng)沉淀回收到的黃原膠濕品中，因含有可燃性的有機(jī)溶劑，應(yīng)采用分批或連續(xù)的真 空干燥、壓力空氣干燥及惰性氣體干燥法進(jìn)行烘干。烘干溫度一般為50°C?80°C，要求  

含水量降至10%以下。烘干的溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品的顏色變深，在水中的溶解時(shí)間增長(zhǎng) 和粘度降低。常用的干燥方法有轉(zhuǎn)筒烘烤干燥法、噴霧干燥法以及瞬間快速干燥法等。

1.6研究?jī)?nèi)容及意義

現(xiàn)如今世界上黃原膠均采用發(fā)酵法生產(chǎn)，一般采用的是間歇式的生產(chǎn)工藝，生 產(chǎn)裝置最大可達(dá)到幾十立方米。由于黃單胞桿菌體積很小、強(qiáng)度很低，黃原膠的發(fā) 酵過(guò)程是一個(gè)比較典型的氣液兩相混合生化反應(yīng)過(guò)程。

目前國(guó)內(nèi)廠家多采用了多層直葉圓盤(pán)渦輪等不恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)器內(nèi)部構(gòu)件，難以滿 足黃原膠發(fā)酵過(guò)程中溶氧和傳熱、傳質(zhì)的需要，因此生產(chǎn)中存在的問(wèn)題正是我們需 要研究的方向，很顯然，要全面解決黃原膠生產(chǎn)技術(shù)中存在的問(wèn)題，首先應(yīng)該從發(fā) 酵工程的角度入手，并引用化學(xué)工程中處理高粘度體系的成功方法，進(jìn)行以下幾方 面的工作：

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同攪拌槳的冷模實(shí)驗(yàn)，選出了兩組消耗功率較小，而氣含率和 XLa值較高的槳型組合：上層槳為下壓式雙折葉圓盤(pán)渦輪（P2DTD)，下層槳為六葉 布魯馬金（6BM)和單獨(dú)最大葉片槳（MB)，將這兩組槳型應(yīng)用于機(jī)械攪拌式生物 反應(yīng)器黃原膠的發(fā)酵，針對(duì)發(fā)酵過(guò)程中黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)：OD、黃原膠濃度、 粘度、平均分子質(zhì)量、丙酮酸功能基團(tuán)以及殘?zhí)菂?shù)的測(cè)定與傳統(tǒng)的六直葉圓盤(pán)渦 輪（6DT)進(jìn)行了對(duì)比研究，以期得到一組適合黃原膠等高粘性物系發(fā)酵的新型攪拌 槳，進(jìn)而開(kāi)發(fā)適合于黃原膠等高粘性物系發(fā)酵的新型機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器。

第一部分：通過(guò)對(duì)三種不同攪拌體系下黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)：OD、黃原膠濃 度、粘度、平均分子質(zhì)量、丙酮酸功能基團(tuán)以及殘?zhí)堑臏y(cè)定，驗(yàn)證了冷模條件下組 合槳（上層下壓式雙折葉圓盤(pán)渦輪，下層六葉布魯馬金）體系和最大葉片式槳體系 具有高氣含率和優(yōu)良傳質(zhì)性能的結(jié)論，更重要的是為工業(yè)上提高黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量和 發(fā)酵質(zhì)量（黃原膠平均分子質(zhì)量和丙酮酸功能基團(tuán)的含量）提供理論指導(dǎo)

第二部分:利用實(shí)驗(yàn)室30L發(fā)酵罐，在對(duì)pH控制的前提下，對(duì)黃單胞桿菌XG-101 的黃原膠間歇生產(chǎn)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)酵在一系列的攪拌速度（140 r/min?260 r/min)下進(jìn)行，其中產(chǎn)品的丙酮酸功能基團(tuán)含量和分子量得到了測(cè)定，隨著攪拌轉(zhuǎn) 速的增加，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)參數(shù)分別增加，同時(shí)，黃原膠在發(fā)酵過(guò)程中的形成也與 微生物的生長(zhǎng)有一定的關(guān)系。另外，本實(shí)驗(yàn)也對(duì)溶氧變化對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響作了

12

研究。

第三部分：利用黃原膠發(fā)酵過(guò)程中，黃單胞菌的生長(zhǎng)繁殖和黃原膠的合成對(duì)營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)的需求不一樣，改變發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基C/N比值，即，黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵， 提供了兩個(gè)合適的環(huán)境：一個(gè)是微生物生長(zhǎng)，另一個(gè)是黃原膠合成，通過(guò)對(duì)MB攪 拌體系下黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)：OD、黃原膠濃度、粘度、平均分子質(zhì)量、丙酮酸 功能基團(tuán)以及殘?zhí)堑臏y(cè)定，不僅驗(yàn)證了最大葉片式槳體系具有高氣含率和優(yōu)良傳質(zhì) 性能的結(jié)論，更重要的是提高了黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量和發(fā)酵質(zhì)量，與傳統(tǒng)的間歇發(fā)酵相 比優(yōu)勢(shì)更加明顯。  

2不同攪拌體系下黃原膠發(fā)酵

2.1前言

在黃原膠的生物發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，由于黃原膠高粘特性，導(dǎo)致發(fā)酵的中后期發(fā) 酵液粘度大，通常在黃原膠含量為2 g/L時(shí)，其溶液粘度即可達(dá)到4000 cp以上[2]。 隨著黃單胞桿菌分泌到自身胞外多糖的積累，給發(fā)酵過(guò)程中的氣液混合、溶氧傳遞、 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞以及熱量的傳遞等帶來(lái)了很大的困難，因此，這一問(wèn)題是目前制約黃 原膠發(fā)酵生產(chǎn)提高的主要因素，而且對(duì)黃原膠的質(zhì)量和發(fā)酵液的流變特性等產(chǎn)生至 關(guān)重要的影響[3,38,39]。因此，改變當(dāng)今國(guó)內(nèi)生產(chǎn)黃原膠普遍使用的六直葉渦輪攪拌槳 體系，延長(zhǎng)氣體在生物發(fā)酵罐內(nèi)的停留時(shí)間，提高全罐的混合效率，研究和開(kāi)發(fā)出 適合黃原膠這種高粘性物系發(fā)酵的新型生物反應(yīng)器，對(duì)于解決黃原膠發(fā)酵過(guò)程中存 在的上述問(wèn)題，有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

針對(duì)上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同攪拌槳的冷模實(shí)驗(yàn)[33]，選出了兩組低功耗高 氣含率和較高XLa值的槳型組合：上層槳為下壓式雙折葉圓盤(pán)渦輪（P2DTD)，下層 槳為六葉布魯馬金（6BM)和單獨(dú)最大葉片槳（MB)，將這兩組槳型應(yīng)用于機(jī)械攪 拌式生物反應(yīng)器黃原膠的發(fā)酵，針對(duì)發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)的變化與傳統(tǒng)的六直葉圓盤(pán) 渦輪（6DT)組合槳進(jìn)行了對(duì)比研究。

2.2實(shí)驗(yàn)材料與方法 2.2.1菌種

囷種：實(shí)驗(yàn)室保存囷種。

2.2.2實(shí)驗(yàn)儀器

烏氏粘度計(jì)上海尼潤(rùn)智能科技有限公司

14

DV-2+PRO數(shù)字式粘度計(jì)上海尼潤(rùn)智能科技有限公司

全自動(dòng)生物反應(yīng)器 MSJ-叱B.E.MARUBISHICO.LTD., JAPAN；

2.2.3培養(yǎng)基[40]

2.2.4實(shí)驗(yàn)及生物反應(yīng)器運(yùn)行條件

2.2.4.1培養(yǎng)方法[40]

2.2.4.2發(fā)酵過(guò)程中黃單胞桿菌的菌體形態(tài)觀察結(jié)果[36]

2.2.5分析方法及原理 2.2.5.1發(fā)酵液中菌體濃度的測(cè)定分光光度計(jì)652 nm處測(cè)定OD值。

2.2.5.2發(fā)酵液粘度的測(cè)定DV-2+PRO數(shù)字式粘度計(jì)，室溫，27號(hào)轉(zhuǎn)子下測(cè)定。 2.2.5.3黃原膠濃度的測(cè)定

用70°%以上的乙醇重復(fù)沉淀黃原膠三次，然后60°C真空干燥，然后準(zhǔn)確稱量所 得黃原膠樣品的干重，黃原膠的質(zhì)量濃度（g/L)=黃原膠的干重（g) /發(fā)酵液的體積 (L)

2.2.5.4還原糖、淀粉濃度的測(cè)定斐林試劑法[41]

2.2.5.5丙酮酸含量的測(cè)定[2,40]

2.2.5.6黃原膠分子量的測(cè)定[5,40]

15 

 

 

 

六直葉圓盤(pán)渦輪（6DT)

下壓式雙折葉圓盤(pán)渦輪（P2DTD) 

 

 

 

最大葉片式槳（MB) 六葉布魯馬金（6BM) 

16

 

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

2.3.1不同攪拌槳體系對(duì)黃原膠發(fā)酵液中微生物量的影響

 

圖2.1 XG-101菌株生長(zhǎng)曲線

Fig.2.1 The growth curve of XG-101

如圖2.1，在發(fā)酵時(shí)間為24 h?36 h時(shí)，黃單胞桿菌的生長(zhǎng)曲線隨發(fā)酵時(shí)間不斷上 升，三種體系下的微生物分別進(jìn)入穩(wěn)定期，MB (最大葉片式攪拌槳）發(fā)酵體系下的 菌體生長(zhǎng)量在進(jìn)入穩(wěn)定期后，明顯優(yōu)于P2DTD+6BM (上層雙折葉圓盤(pán)渦輪攪拌槳+ 下層六葉布魯馬金攪拌槳）組合的發(fā)酵體系下的微生物生長(zhǎng)量，并且隨著時(shí)間的推 進(jìn)，不同攪拌體系下的微生物量都有不同程度的下降，但MB發(fā)酵體系下的微生物量 下降相對(duì)較小，究其原因是因?yàn)槔淠Ｑ芯勘砻鳎琈B攪拌槳體系下與其他組合槳體系 下相比，MB體系具有較高的溶氧水平，上述實(shí)驗(yàn)所獲的實(shí)驗(yàn)結(jié)論與華璟薇研究結(jié)果 一致[42]。

17 

(loss崧蠢«

 

〇〇 IT—T——T ■ I ■ I ■ I I I ■ I ■ I ■ I ■ I I I

* 010 20 30 40 506070 80 90 100

發(fā)酵時(shí)間（h)

 

圖2.2發(fā)酵液中黃原膠濃度隨時(shí)間的變化 Fig.2.2 Relationship between xanthan concentration and fermentation time

黃原膠屬胞外次級(jí)代謝產(chǎn)物[43]，隨著黃原膠的生成并在發(fā)酵液中的積累，導(dǎo)致發(fā) 酵液粘度增加迅速，限制了溶氧氧和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，從而制約了黃原膠發(fā)酵 液濃度的繼續(xù)增加。如圖2.2所示，78小時(shí)后發(fā)酵液中黃原膠濃度繼續(xù)增加， P2DTD+6BM和MB體系下黃原膠濃度的增長(zhǎng)幅度高于6TD+6TD。P2DTD+6BM和 MB都具有較好的氣液分散效果，在一定程度上克服了黃原膠發(fā)酵中后期存在的上述 問(wèn)題。

2.3.3不同攪拌槳體系對(duì)發(fā)酵液中黃原膠粘度的影響

18 

 

Fig.2.3 Relationship between viscosity and fermentation time

圖2.3可見(jiàn)，P2DTD+6BM和MB體系下發(fā)酵中后期發(fā)酵液的粘度高于6TD+6TD 體系發(fā)酵液的粘度，通常黃原膠發(fā)酵液的粘度與黃原膠的平均分子量和濃度之間存 在著正相關(guān)的關(guān)聯(lián)。從圖2.2和圖2.4可以看出，P2DTD+6BM和MB體系下發(fā)酵液 中黃原膠濃度的增加與其平均分子質(zhì)量的增加均高于6TD+6TD體系，根據(jù)黃原膠發(fā) 酵液粘度與黃原膠濃度、平均分子量間的正相關(guān)關(guān)系，因此只有在黃原膠濃度相似 的條件下，黃原膠發(fā)酵液的粘度才會(huì)隨黃原膠平均分子量的增加而增加。

19

 

圖2.4發(fā)酵黃原膠平均分子質(zhì)量隨時(shí)間的變化 Fig.2.4 Relationship between xanthan gum average molecular weight and fermentation time

正如圖2.4所示，P2DTD+6BM和MB體系下發(fā)酵所得黃原膠質(zhì)量明顯優(yōu)于 6TD+6TD體系發(fā)酵所得黃原膠質(zhì)量，其中MB體系下發(fā)酵所得黃原膠質(zhì)量最佳，其 最終其平均分子質(zhì)量高達(dá)：1.21xi〇7 g/mol，而6TD+6TD和P2DTD+6BM體系下最 終所得黃原膠平均分子質(zhì)量分別為：6.6x1〇6 g/mol、9.83x1〇6 g/mol。三種發(fā)酵體系下 黃原膠平均分子量均在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)達(dá)到最大值：7.5x1〇6 g/mol、1.1x1〇7 g/mol、1.3x1〇7g/mol，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，黃原膠平均分子質(zhì)量一直下降，結(jié)果與 I.S.Suh和II-Soon Suh的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合[3-4]。

20

5.8■

 

5.5■

5.48■

5.24■

5.16■

6DT+6DT(M) 6DT+6DT(S) P2DTD+6BM(MP2DTD+6BM(S) MB

不同發(fā)酵體系

圖2.5不同攪拌體系下發(fā)酵所得黃原膠中丙酮酸功能基團(tuán)含量 Fig.2.5 Relationship between pyruvic acid functional groups concentration and fermentation time

圖2.5結(jié)果顯示，P2DTD+6BM (M=Movement)和MB體系下發(fā)酵所得丙酮酸

功能基團(tuán)含量明顯高于6TD+6TD (M)體系，并且，同一發(fā)酵體系下運(yùn)動(dòng)區(qū)丙酮酸 功能基團(tuán)含量明顯高于停滯區(qū)：6TD+6TD (M)> 6TD+6TD (S) P2DTD+6BM (M=Movement)> P2DTD+6BM (Stagnancy)。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于具有較

高溶氧水平的P2DTD+6BM和MB發(fā)酵體系，所得丙酮酸功能基團(tuán)含量明顯較高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示：不同發(fā)酵體系下較好的溶氧水平是保證較高丙酮酸功能基 團(tuán)含量的重要因素。

21 

4.0

 

0102030405060708090100

發(fā)酵時(shí)間（h)

圖2.6發(fā)酵液中淀粉含量隨時(shí)間的變化 Fig.2.6 Relationship between amylum concentration and fermentation time

圖2.6所示，6TD+6TD體系下最終發(fā)酵液中淀粉濃度高于MB和P2DTD+6BM 體系。碳源不僅是合成黃原膠的最基本物質(zhì)，也是黃單胞桿菌生長(zhǎng)繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)， 黃原膠的濃度與碳源種類和底物濃度有著直接的關(guān)系。以淀粉質(zhì)為原料的發(fā)酵初始， 由于淀粉的酶解和液化，培養(yǎng)基中生成適量的葡萄糖，此后隨著菌體的迅速繁殖， 其分泌的胞外淀粉酶含量也隨著增加，淀粉被逐漸水解為葡萄糖，發(fā)酵液中淀粉濃 度隨之降低，葡萄糖濃度增加，黃單胞桿菌根據(jù)自身對(duì)葡萄糖需求的多少，來(lái)產(chǎn)生 胞外淀粉酶，從而使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度處于最適。

22 

 

圖2.7發(fā)酵液中葡萄糖含量隨時(shí)間的變化 Fig.2.7 Relationship between glucose concentration and fermentation time

如圖2.7所示，實(shí)驗(yàn)中黃原膠發(fā)酵結(jié)束時(shí)MB和P2DTD+6BM體系發(fā)酵液中的 葡萄糖含量基本相同，均下降到0.5 g/100mL左右，均比6TD+6TD體系下的葡萄糖 含量（0.81 g/100mL)低，MB和P2DTD+6BM體系下的葡萄糖含量明顯低于 6TD+6TD體系下的葡萄糖含量，發(fā)酵液中生成的葡萄糖一些用來(lái)維持微生物正常的 新陳代謝，另外，就是用來(lái)合成黃原膠，正如圖2.2所示，MB和P2DTD+6BM體系 下發(fā)酵所得黃原膠產(chǎn)量比6TD+6TD體系下的產(chǎn)量高很多。

2.4結(jié)論

本章在最佳發(fā)酵工藝條件下，針對(duì)不同攪拌槳組合對(duì)黃原膠發(fā)酵過(guò)程的影響進(jìn) 行了研究，黃單胞桿菌發(fā)酵合成黃原膠的工程基礎(chǔ)研究，得出以下結(jié)論：

1、上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了冷模實(shí)驗(yàn)下的結(jié)論：MB和P2DTD+6BM體系具有較高的 XLa值和氣含率。

2、在MB和P2DTD+6BM體系下較好的宏觀穩(wěn)定流型、較高的傳質(zhì)系數(shù)，增加 了發(fā)酵液中黃原膠的濃度，提高了底物淀粉的轉(zhuǎn)化率，減少了最終發(fā)酵液中淀粉的

殘留量。

3、P2DTD+6BM體系下發(fā)酵推動(dòng)了更大范圍的液體，降低了靜止區(qū)的厚度，尤

23

其值得一提的是，MB體系下發(fā)酵幾乎不存在滯留區(qū)，MB和P2DTD+6BM體系下 不僅提高了最終黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量，更重要的是提高了黃原膠平均分子質(zhì)量和丙酮酸 功能基團(tuán)的含量。

24

3攪拌和溶氧對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響

3.1前言

由于黃原發(fā)酵液流變學(xué)的復(fù)雜性，攪拌速度影響的不僅是發(fā)酵液的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)還 有氧的傳質(zhì)速率，攪拌作用包含對(duì)溶液的剪切稀化和空氣的作用，兩者是相互作用 的。在黃原膠發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行胞外多糖的不斷積累，導(dǎo)致發(fā)酵液的粘 度也來(lái)越大，因此，把溶氧分成兩個(gè)階段：（1)氣液的混合；（2)溶解于液體中的氧 穿透胞外多糖順利運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。Flores,Suh曾報(bào)道黃原膠質(zhì)量受到氧攝入比速率的 顯著影響，Amanullah認(rèn)為氧攝入比速率的變化依賴混合的程度。因此，當(dāng)黃原膠的 濃度超過(guò)20 g/L時(shí)，在較低的攪拌速率下，可能會(huì)產(chǎn)生相對(duì)差的混合，從而導(dǎo)致較 差的黃原膠質(zhì)量，因此攪拌對(duì)于黃原膠質(zhì)量的提高起著至關(guān)重要的作用[23]。Moraine 和Rogovin，Kennedy以及Funahashi認(rèn)為這是由于黃單胞桿菌周?chē)舛嗵堑牟粩?積累，增加了氧氣和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)淖枇?，?dāng)增加攪拌速度的時(shí)候產(chǎn)生的有利 作用的原因是：使胞外的多糖層變薄，從而提高了黃原膠形成所必需的氧和營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)的運(yùn)輸[24]。

黃原膠溶液展現(xiàn)出來(lái)的流變學(xué)特性是由其化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子排布和分子間的締合、 平均分子量和分子量的分布共同決定的。很多微生物其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)和多糖的產(chǎn)率、 分子量以及它們的結(jié)構(gòu)都受到生長(zhǎng)環(huán)境的影響[3,38,39]。雖然大多數(shù)胞外多糖的基本碳 鏈結(jié)構(gòu)不受生長(zhǎng)環(huán)境的影響，但是其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)基團(tuán)是會(huì)發(fā)生很大的變化，如：黃原 膠側(cè)鏈的丙酮?；鸵阴；?。丙酮酸功能基團(tuán)是黃原膠分子側(cè)鏈末端甘露糖上 的一個(gè)組成部分，在黃原膠分子中只是部分側(cè)鏈上帶有丙酮酸功能基團(tuán)，如果全部 側(cè)鏈均帶有丙酮酸功能基團(tuán)，則黃原膠中丙酮酸功能基團(tuán)的含量達(dá)到理論最大值 (8.69%) [21]。丙酮酸含量的變化會(huì)影響黃原膠大分子的空間排列、電荷在大分子上 的分布以及大分子的交聯(lián)，引起黃原膠溶液粘度、耐溫性、和分子量的變化，從而 賦予黃原膠許多獨(dú)特的流變性和功能特性。黃原膠有許多優(yōu)良而獨(dú)特的性能，但最 基本的是增稠性。其增稠性與黃原膠的分子量密切相關(guān)，分子量越大，黃原膠溶液

25

的粘度越高。根據(jù)黃原膠的生物合成機(jī)理，黃原膠的分子量依賴于黃原膠生物合成 時(shí)的聚合度，而聚合度又與發(fā)酵條件有關(guān)[19]。

在黃原膠的生物發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，由于黃原膠具有高粘度的特性，導(dǎo)致發(fā)酵液 中后期粘度大，通常當(dāng)發(fā)酵液中的黃原膠含量為2 g/L時(shí)，其粘度即可達(dá)到4000 cp 以上。隨著黃單胞桿菌分泌到自身胞外多糖的積累，給發(fā)酵過(guò)程中的氣液混合、溶 氧傳遞、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞以及熱量的傳遞等帶來(lái)了很大的困難，由于攪拌和溶氧是影 響黃原膠發(fā)酵的重要因素，尤其對(duì)黃原膠的質(zhì)量：粘度、分子量大小、分子量分布、 丙酮酸含量、流變特性等產(chǎn)生至關(guān)重要的影響，因此，本試驗(yàn)從攪拌轉(zhuǎn)速和溶氧的 改變對(duì)黃原膠發(fā)酵進(jìn)行研究。

利用實(shí)驗(yàn)室30 L發(fā)酵罐，在對(duì)pH控制的前提下，對(duì)黃單胞桿菌XG-101的黃原 膠間歇生產(chǎn)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)酵在一系列的攪拌速度（140 r/min?260 r/min) 下進(jìn)行，其中產(chǎn)品的丙酮酸功能基團(tuán)含量和分子量得到了測(cè)定，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增 加，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)參數(shù)分別增加，同時(shí)，黃原膠在發(fā)酵過(guò)程中的形成也與微生物 的生長(zhǎng)有一定的關(guān)系。另外，本實(shí)驗(yàn)也對(duì)溶氧變化對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響作了研究。

3.2實(shí)驗(yàn)材料與方法

3.2.1菌種

同 2.2.1

3.2.2實(shí)驗(yàn)儀器

同 2.2.2

3.2.3培養(yǎng)基

同 2.2.3

3.2.4實(shí)驗(yàn)及生物反應(yīng)器運(yùn)行條件

同 2.2.4

26

3.2.5分析方法及原理

同2.2.5方法

3.2.6反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)

 

最大葉片式槳（MB)新型氣體分布器

3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.3.1不同攪拌槳體系對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響 3.3.1.1不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液中微生物量的影響

27

 

圖3.1 XG-101菌株不同攪拌轉(zhuǎn)速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下的生長(zhǎng)曲線 Fig.3.1 The growth curve of XG-101 time-courses in fermentation performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min

M. Papagianni利用實(shí)驗(yàn)室2L的發(fā)酵罐，在pH沒(méi)有控制的前提下，對(duì)黃單胞 桿菌dTUC 1395的黃原膠間歇生產(chǎn)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)酵分別在不同的的 攬拌轉(zhuǎn)速（100 r/min、200 r/min、300 r/min、400 r/min、600 r/min)下發(fā)酵，保證在 72 h在速度100 r/min的時(shí)候不低于飽和度的5°%，同時(shí)在600 r/min時(shí)不低于飽和度 的10°%。結(jié)果顯示攪拌轉(zhuǎn)速在600 r/min時(shí)，與轉(zhuǎn)速在200 r/min時(shí)相比，黃原膠產(chǎn) 量和菌體濃度幾乎分別增加兩倍，并將胞外多糖中的丙酮酸和其分子量關(guān)聯(lián)起來(lái)。 黃原膠有效的生成是在600 r/min，在這個(gè)速度下，能保證一個(gè)較好的溶氧[2]。這些 與作者前期的研究一致：要想獲得較高的產(chǎn)量，較高的溶氧是必需的。Amanullah在 其研究中也闡述道，當(dāng)黃原膠濃度達(dá)到20 g/L時(shí)，微生物的氧攝入速率更快，所以 攪拌轉(zhuǎn)速為1000 r/min時(shí)（與轉(zhuǎn)速為500 r/min相比），黃原膠的產(chǎn)量增加。生物量 隨著攪拌速度的增加而增加，然而在Amanullah的報(bào)道中當(dāng)攪拌速度500 r/min與 1000 r/min相比，并沒(méi)有引起生物量的變化[23]。

如圖3.1所示，菌體生長(zhǎng)曲線隨發(fā)酵時(shí)間不斷上升，在36小時(shí)，分別進(jìn)入穩(wěn)定期， 轉(zhuǎn)速為200 r/min的菌體濃度比轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)的菌體濃度要高，并且隨著轉(zhuǎn)速的繼 續(xù)增加260 r/min時(shí)兩個(gè)相差不再明顯，結(jié)果也顯示隨著轉(zhuǎn)速的增加，較高轉(zhuǎn)速下的 發(fā)酵體系微生物穩(wěn)定期相對(duì)較長(zhǎng)，另一方面也說(shuō)明較高的轉(zhuǎn)速具有較高的溶氧水平，

28

與華璟薇研究結(jié)果一致：發(fā)酵液中的溶氧濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)速率影響不大，但是對(duì)菌 體濃度達(dá)到最大之后的菌體的穩(wěn)定期的長(zhǎng)短卻有著明顯的影響。當(dāng)溶氧濃度只有飽 和濃度的6.25%，即DO=6%時(shí)，此穩(wěn)定期只有9個(gè)小時(shí)；而當(dāng)溶氧濃度為其飽和值的 25%時(shí)，即DO=25%，此穩(wěn)定期可達(dá)28個(gè)小時(shí)以上。通常當(dāng)發(fā)酵液溶氧濃度過(guò)低時(shí)， 穩(wěn)定期短，說(shuō)明菌體的呼吸受到限制，菌體活力受到影響[30]。

3.3.1.2不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液中黃原膠濃度的影響

 

圖3.2黃原膠濃度在不同攪拌轉(zhuǎn)速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下隨發(fā)酵時(shí)間的變化 Fig.3.2 Xanthan concentration time-courses in fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min

由于黃原發(fā)酵液流變學(xué)的復(fù)雜性，攪拌速度影響的不僅是發(fā)酵液的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)還 有氧的傳質(zhì)速率，攪拌作用包含對(duì)溶液的剪切稀化和空氣的作用，兩者是相互作用 的。因此，當(dāng)黃原膠的濃度超過(guò)20 g/L時(shí)，在較低的攪拌速率下，可能會(huì)產(chǎn)生相對(duì) 差的混合，從而導(dǎo)致較差的黃原膠質(zhì)量，因此攪拌對(duì)于黃原膠質(zhì)量的提高起著至關(guān) 重要的作用[14]。如圖3.2所示，發(fā)酵結(jié)束時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min和260 r/min時(shí)的產(chǎn)量 分別為:2.82 g/100mL 和 2.95 g/100mL，而轉(zhuǎn)速 140 r/min 時(shí)的產(chǎn)量?jī)H為 2.14 g/100mL， 由此可見(jiàn)，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高，黃原膠產(chǎn)量迅速的增加，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速上升到一定 的轉(zhuǎn)速時(shí)，產(chǎn)量增加變化便不再顯著。對(duì)于黃原膠產(chǎn)量的迅速提高M(jìn)oraine和

29

Rogovin，Kennedy以及Funahashi認(rèn)為這是由于黃單胞桿菌周?chē)舛嗵堑牟粩喾e

累，增加了氧氣和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)淖枇Γ?dāng)增加攪拌速度的時(shí)候產(chǎn)生的有利作 用的原因是：使胞外的多糖層變薄，從而提高了黃原膠形成所必需的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 的運(yùn)輸[8]。

3.3.1.3不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液中黃原膠粘度的影響

 

圖3.3黃原膠粘度在不同攪拌轉(zhuǎn)速(140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下隨發(fā)酵時(shí)間的變

化

Fig.3.3 Xanthan viscosity time-courses in

fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min

如圖3.3所示，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，200 r/min和260 r/min發(fā)酵體系下發(fā)酵中 后期黃原膠發(fā)酵液的粘度高于140 r/min發(fā)酵體系發(fā)酵液的粘度。通常黃原膠發(fā)酵液 的粘度與黃原膠的濃度、平均分子量之間有著正相關(guān)的關(guān)系。對(duì)照?qǐng)D3.2和圖3.4可 以看出，200 r/min和260 r/min發(fā)酵體系下發(fā)酵液中黃原膠濃度的增加與其平均分子 質(zhì)量的增加均高于140 r/min發(fā)酵體系，根據(jù)黃原膠發(fā)酵液粘度與黃原膠濃度、平均 分子量間的正相關(guān)關(guān)系，只有在平均分子量相近的條件下，黃原膠發(fā)酵液的粘度才 會(huì)隨其濃度的增加而增加。

3.3.1.4不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)黃原膠平均分子質(zhì)量的影響

30

 

圖3.4黃原膠平均分子質(zhì)量在不同攪拌轉(zhuǎn)速 (140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下隨發(fā)酵時(shí)間的變化 Fig.3.4 Xanthan average molecular weight time-courses in fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min

在不同的生長(zhǎng)階段，產(chǎn)生的黃原膠分子的分子量和取代程度是不同的，因此， 發(fā)酵結(jié)束后所得到的黃原膠是不同結(jié)構(gòu)分子的混合物。Peters利用15 L機(jī)械攪拌生 物反應(yīng)器在不同攪拌速度（200 r/min?800 r/min)下實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在較低的攪拌速率下， 溶氧限制較早的出現(xiàn)，發(fā)酵生產(chǎn)出的黃原膠的平均分子量（Mw)也會(huì)越低[25]。Flores, Suh曾報(bào)道黃原膠質(zhì)量受到氧攝入比速率的顯著影響，Amanullah認(rèn)為氧攝入比速率 的變化依賴混合的程度。因此，在黃原膠發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行胞外多糖的 不斷積累，導(dǎo)致發(fā)酵液的粘度也來(lái)越大，把溶氧分成兩個(gè)階段：（1)氣液的混合；（2) 溶解于液體中的氧穿透胞外多糖順利運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，使胞外 的多糖層變薄，從而提高了黃原膠形成所必需的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。

正如圖3.4所示，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速分別為140 r/min、200 r/min和260 r/min時(shí)，在發(fā) 酵時(shí)間60h,黃原膠平均分子質(zhì)量分別達(dá)到最大：1.1x107 g/mol、1.44x107 g/mol和 1.48X107 g/mol，其后隨著發(fā)酵的進(jìn)行，黃原膠平均分子質(zhì)量一直下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí) 的黃原膠平均分子質(zhì)量依次為：9.012x106 g/mol、1.337x107 g/mol 和 1.391x107 g/mol, 結(jié)果顯示，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高，黃原膠平均分子質(zhì)量也在提高，同時(shí)，通過(guò)圖3.5 趨勢(shì)線發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵中后期200 r/min和260 r/min時(shí)的黃原膠平均分子質(zhì)量下降的趨勢(shì)

31

明顯小于140 r/min時(shí)的下降趨勢(shì)。結(jié)果與I.S.Suh和II-Soon Suh的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合[3-4]。

對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黃原膠平均分子質(zhì)量達(dá)到最大值，其后隨著發(fā)酵進(jìn)入 穩(wěn)定期，黃原膠平均分子質(zhì)量下降，本文作者給出了合理解釋[40]。

3.3.1.5不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)丙酮酸功能基團(tuán)含量的影響

7 I-

 

140r/min200r/min260r/min260r/min(T)

不同發(fā)酵體系

圖3.5丙酮酸功能基團(tuán)在不同攪拌轉(zhuǎn)速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下92小時(shí)的含量 Fig.3.5 Pyruvic acid functional groups concentration of 92 h xanthan samples from fermentations carried out at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min.

M. Papagianni研究表明在發(fā)酵的72小時(shí)，對(duì)于不同攪拌速度（100 r/min?600 r/min)下，利用HPLC對(duì)其丙酮含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其隨著攪拌速度的提高而增加，眾 所周知，丙酮酸含量主要依賴菌株和培養(yǎng)基的選擇[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3.5所示，隨著 攪拌轉(zhuǎn)速的提高，丙酮酸功能基團(tuán)含量也在增加。Peters提出微生物對(duì)氧的需求和丙 酮酸含量?jī)烧咧g存在著直接的聯(lián)系：較高的速度將會(huì)提高溶氧水平，而丙酮酸依 賴氧的供給，從而解釋了在較高的攪拌轉(zhuǎn)速下得到較高的丙酮酸含量[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 也顯示：在較高轉(zhuǎn)速下獲得的較高的溶氧水平是保證較高丙酮酸功能基團(tuán)含量的重 要因素。 3.3.1.6不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液中碳源濃度的影響

32 

—■一 140 r/min —•— 200 r/min —▲— 260 r/min

-4-2-0-8-6-4-2-0-8 3-3-3-2-2-2-2-2-1-

(1〇102/§}«^«誕

 

. I. I. I. I. I. I. I. I. I. I

0102030405060708090100

發(fā)酵時(shí)間（h)

 

1.2

圖3.6淀粉濃度在不同攪拌轉(zhuǎn)速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下隨發(fā)酵時(shí)間的變化 Fig.3.6 Amylum concentration time-courses in fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min.

圖3.6所示，200 r/min和260 r/min發(fā)酵體系下最終發(fā)酵液中淀粉濃度低于140 r/min發(fā)酵體系。碳源不僅是合成黃原膠的基質(zhì)，也是菌體增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，黃原膠 的產(chǎn)量與碳源種類和底物濃度有著直接的關(guān)系。通常發(fā)酵液中淀粉濃度、葡萄糖濃 度、產(chǎn)物的濃度之間存在著一種動(dòng)態(tài)平衡。以淀粉質(zhì)為原料的黃原膠發(fā)酵初始，由 于淀粉的液化，培養(yǎng)基中存在少量的葡萄糖，此后隨著菌體的迅速繁殖，其分泌的 胞外淀粉酶活力也隨著增加，淀粉被逐漸水解為葡萄糖，發(fā)酵液中淀粉濃度隨之降 低，葡萄糖濃度增加。

33 

—■—140 r/m

—200 r/m 一▲一 260 r/m

1-1-1-0-0- (1S00T/-塒茲海擗解

 

04 -

■ i ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I

01020 30 405060 70 8090 100

發(fā)酵時(shí)間（h)

圖3.7還原糖濃度在不同攪拌轉(zhuǎn)速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下隨發(fā)酵時(shí)間的變化 Fig.3.7 Glucose concentration time-courses in fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min.

 

在任何微生物發(fā)酵過(guò)程中，根據(jù)生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，當(dāng)發(fā)酵液中的底物下降 到一定濃度時(shí)，菌體代謝速率非常緩慢，在工業(yè)生產(chǎn)中可以結(jié)束發(fā)酵。如圖3.7所示， 黃單胞桿菌發(fā)酵合成黃原膠的工程基礎(chǔ)研究，實(shí)驗(yàn)中黃原膠發(fā)酵結(jié)束時(shí)200 r/min和260 r/min發(fā)酵體系中的葡萄糖含量均下降到 0.56 g/100mL左右，均比140 r/min發(fā)酵體系下的葡萄糖含量（0.87 g/100mL)低。碳 源一部分用來(lái)構(gòu)成細(xì)胞成分，一部分維持正常的新陳代謝，另外一部分用于目的產(chǎn) 物的合成，200 r/min和260 r/min發(fā)酵體系下的殘?zhí)呛棵黠@低于140 r/min發(fā)酵體 系下的殘?zhí)?，這些一部分用來(lái)維持微生物正常的新陳代謝，另外，就是用來(lái)合成黃 原膠，正如圖3.2和圖3.4所示，200 r/min和260 r/min發(fā)酵體系下發(fā)酵所得黃原膠 產(chǎn)量和平均分子質(zhì)量比140 r/min體系下的產(chǎn)量和平均分子質(zhì)高很多。

3.3.2溶氧對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響

I.S.Suh利用鼓泡柱（Suh和Pons指出鼓泡柱具有良好混合性，不存在停滯區(qū)）， 利用不同的通氣速率（UG=0.051m/s、0.100 m/s、0.165 m/s、0.361 m/s):黃原膠分

子量的大小受氧傳遞速率限制的影響較大，有時(shí)與其呈線性關(guān)系，不同通氣速率下 分別發(fā)酵，最初的黃原膠平均分子質(zhì)量相差很大，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)（30 h)平 均分子質(zhì)量迅速的增加到相似的最大值（8.8x106 g/mol?9.4x106 g/mol)，黃原膠的

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濃度僅為6.7 g/L。進(jìn)入穩(wěn)定期后，黃原膠平均分子質(zhì)量下降，下降的速率與通氣速 率有顯著的關(guān)系（通氣速率較低條件下發(fā)酵所得黃原膠平均分子質(zhì)量與通氣速率較 高條件下發(fā)酵所的黃原膠平均分子質(zhì)量相比，前者進(jìn)入穩(wěn)定期后，下降更為迅速）， 其研究還顯示，在較低的通氣速率下（UG =0.051 m/s)時(shí)，分別在t=30 h和t=154 h 所得黃原膠分子量分布表明：t=30 h (對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期剛結(jié)束時(shí)）所得黃原膠離散度比 t=154 h所得黃原膠離散度要小，并且前者所得黃原膠分子量在7x106 g/mol?4x107 g/mol中所占的含量比后者多[26]。

Fernado Flores在2 L的機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器內(nèi)研究結(jié)果表明：當(dāng)控制發(fā)酵過(guò) 程的溶氧在相對(duì)溶氧濃度DO=40°%以上時(shí)，黃原膠的平均分子量可達(dá)10x106 g/mol， 而且其產(chǎn)物中高分子量聚合物的比例隨著溶氧濃度DO值的增加而增加[29]。雖然影 響黃原膠生物合成機(jī)理尚不清楚，但是發(fā)酵液中高的溶氧濃度有利于黃原膠分子的 聚合時(shí)非常明顯的。相同實(shí)驗(yàn)證明，溶氧濃度越高其黃原膠的生物合成開(kāi)始的越早， 而黃原膠生成的停止通常是由于培養(yǎng)基中碳源的耗盡造成的，從某種意義上講，高 濃度黃原膠發(fā)酵液的得到必須有較高的溶氧濃度為前提的[30]。

在化工生產(chǎn)中，通氣機(jī)械攪拌式反應(yīng)器得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在發(fā)酵工業(yè) 當(dāng)中，大多數(shù)反應(yīng)器是這種類型。但在工業(yè)具體應(yīng)用中，常常會(huì)遇到一些特殊情況。 例如在黃原膠發(fā)酵過(guò)程中，由于胞外多糖的積累，發(fā)酵液的粘度增加，導(dǎo)致體系中 氧傳遞困難，氧傳遞速率成為控制整個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵步驟。雖然增大攪拌轉(zhuǎn)速可以提 高體系內(nèi)的溶氧水平，但高剪切的機(jī)械攪拌很容易對(duì)微生物造成損害。這就對(duì)發(fā)酵 工藝的改善、新型生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)及其內(nèi)部構(gòu)件(攪拌槳、氣體分布器等）的優(yōu)化 提出了新的要求。目前，文獻(xiàn)中對(duì)反應(yīng)釜內(nèi)部構(gòu)件中攪拌槳的研究較多，而有關(guān)氣 體分布器的報(bào)道相對(duì)較少。傳統(tǒng)分布器型式有：?jiǎn)慰字惫芊植计鳌h(huán)狀多孔分布器、 多孔環(huán)簇分布器和錐形多孔分布器等，其中最常用的是環(huán)狀氣體分布器。馮連芳等 曾用小于槳徑的環(huán)狀分布器和大于槳徑的分布器進(jìn)行過(guò)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用大直 徑分布環(huán)要優(yōu)于小直徑分布環(huán)。張炎等研究了一種帶有靜態(tài)混合器噴嘴的氣體分布 器，認(rèn)為這種分布器型式有利于形成泰勒渦柱，使平行于攪拌軸方向的流體沒(méi)有速 度梯度，不存在返混作用，大量氣泡能有序的運(yùn)動(dòng)，減少了氣泡間的碰撞和聚并， 有利于氣液相界面積的增加[34]。

本實(shí)驗(yàn)是在生物反應(yīng)器內(nèi)其他設(shè)備和發(fā)酵條件不變的前提下，通過(guò)改變氣體分 布器的結(jié)構(gòu)，從而改變氣泡的大小，進(jìn)而促使發(fā)酵液中溶氧濃度發(fā)生變化，進(jìn)而間

35

接的研究溶氧的變化對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。

通過(guò)新型氣體分布器(見(jiàn)3.2.6)與傳統(tǒng)環(huán)狀分布器的比較發(fā)現(xiàn)，新型氣體分布器 來(lái)改變?nèi)苎?，使分散出的氣體盡可能小，不僅可以延長(zhǎng)氣體在發(fā)酵液中的滯留時(shí)間， 同時(shí)加大了氣液接觸面積，從而增加溶氧推動(dòng)力，這對(duì)于反應(yīng)器內(nèi)部構(gòu)件的優(yōu)化和 黃原膠發(fā)酵質(zhì)量的提高最具有重要的意義，為其他行業(yè)中高粘體系的發(fā)酵提供了理 論指導(dǎo)和思路。

表格3.1溶氧對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響(92h)

Tab.3.1 Effect of agitator speed and dissolved oxygen on xanthan fermentation

最大葉片 式槳黃原膠含量 (g/100mL)黃原膠粘度

(cp)黃原膠平均分子 質(zhì)量 (g/mol)丙酮酸功能基團(tuán) 含量 (%)

260 r/m(T)2.531782.51.21x1075.5

260 r/m(N)2.9524571.39x1076.2

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3.1所示，在相同轉(zhuǎn)速下，260 r/min(New)發(fā)酵體系與260 r/min

(Traditional)發(fā)酵體系相比，各項(xiàng)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)明顯優(yōu)于后者，可見(jiàn)溶氧對(duì)于黃 原膠發(fā)酵質(zhì)量有著至關(guān)重要決定作用。

3.4結(jié)論

利用實(shí)驗(yàn)室30 L發(fā)酵罐，在對(duì)pH控制的前提下，對(duì)黃單胞桿菌XG-101的黃 原膠間歇生產(chǎn)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)酵在一系列的攪拌速度（140 r/min?260 r/min)下進(jìn)行，結(jié)果顯示：

1、隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)參數(shù)分別增加，同時(shí)，黃原膠在發(fā) 酵過(guò)程中的形成也與微生物的生長(zhǎng)有一定的關(guān)系。

2、菌體生長(zhǎng)曲線隨發(fā)酵時(shí)間不斷上升，在36小時(shí)，分別進(jìn)入穩(wěn)定期，轉(zhuǎn)速為 200 r/min的菌體濃度比轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)的菌體濃度要高，并且隨著轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增 加260 r/min時(shí)兩個(gè)相差不再明顯。

3、結(jié)果也顯示隨著轉(zhuǎn)速的增加，較高轉(zhuǎn)速下的發(fā)酵體系微生物穩(wěn)定期相對(duì)較 長(zhǎng)，另一方面也說(shuō)明較高的轉(zhuǎn)速具有較高的溶氧水平，與華璟薇研究結(jié)果一致：發(fā)

36

酵液中的溶氧濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)速率影響不大，但是對(duì)菌體濃度達(dá)到最大之后的菌體 的穩(wěn)定期的長(zhǎng)短卻有著明顯的影響。

4、本研究通過(guò)新型分布器與傳統(tǒng)環(huán)狀分布器的比較發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)的新型氣體分 布器來(lái)改變?nèi)苎?，使分散出的氣體盡可能小，不僅可以延長(zhǎng)氣體在發(fā)酵液中的滯留 時(shí)間，同時(shí)加大了氣液接觸面積，從而增加溶氧推動(dòng)力，這對(duì)于反應(yīng)器內(nèi)部構(gòu)件的 優(yōu)化和黃原膠發(fā)酵質(zhì)量的提高最具有重要的意義，同時(shí)，為其他行業(yè)中高粘體系的 發(fā)酵提供了理論指導(dǎo)和思路。

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4黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的試驗(yàn)研究

4.1前言

一般來(lái)說(shuō)，黃單胞菌的生長(zhǎng)繁殖和黃原膠的合成對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求是不一樣的， Davidson研究表明較高的C/N比更有利于黃原膠的合成，一個(gè)相對(duì)較高的氮源濃度 是微生物的快速生長(zhǎng)和較高的菌體濃度所必需的，而其更加有利于縮短發(fā)酵周期。 然而，Souw、Demain以及Kenndy等研究表明培養(yǎng)基中氮源的濃度太高的話，對(duì)黃 原膠的發(fā)酵也非常不利。Quinlan認(rèn)為發(fā)酵期間菌體生長(zhǎng)和黃原膠合成受不同階段被 耗盡的兩種基質(zhì)限制。黃原膠的濃度受授葡萄糖濃度的限制，然而菌體的濃度基本 上受可以利用氮源濃度的限制。Pinches和Pallent也指出速率和得率兩個(gè)參數(shù)是獨(dú)立 于最初的氮源的濃度的，但穩(wěn)定期黃原膠合成比速率依賴于培養(yǎng)基中的最初的氮源 濃度。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中組成對(duì)于黃原膠發(fā)酵的矛盾影響，現(xiàn)在工業(yè)發(fā)酵黃原膠在微生 物生長(zhǎng)和黃原膠合成兩階段提供合適的培養(yǎng)基。

I.W.sutherland研究認(rèn)為，對(duì)于好氣菌來(lái)說(shuō)，高氧量和低C/N比值促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)， 相對(duì)低的氧量和高C/N比值則利于胞外多糖合成。研究者們也普遍認(rèn)為較高的氮源 濃度對(duì)于較快的微生物生長(zhǎng)和較高的微生物濃度是有利的[16]，然而Garcia-Ochoa和 Schweickart以及Quinlan認(rèn)為較高的碳源濃度對(duì)于黃原膠的合成更加有利。張禹等 研究發(fā)現(xiàn)C/N對(duì)發(fā)酵速度、發(fā)酵周期有重要的影響，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始，采用較高 的C/N (大約50: 1)促進(jìn)黃原膠的合成。同一批黃原膠發(fā)酵周期的延長(zhǎng)，丙酮酸含 量不斷的增加。因此，C/N通過(guò)控制生長(zhǎng)速度將其作用傳遞給丙酮酸的合成[15]。

基于黃原膠發(fā)酵過(guò)程中微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成不同階段對(duì)C/N需求不同， Yang-Ming Lo將G/YE (葡萄糖/酵母浸粉）的兩階段發(fā)酵工藝應(yīng)用于黃原膠發(fā)酵過(guò) 程中：黃單胞桿菌發(fā)酵合成黃原膠的工程基礎(chǔ)研究，發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)利用較低的G/YE (2.5°%/0.3°%)，當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束的時(shí)候一次 添加額外的葡萄糖（2.5%)，從而創(chuàng)造一個(gè)較高的G/YE環(huán)境，發(fā)酵所得的黃原膠質(zhì) 量與間歇發(fā)酵G/YE (5.0°%/0.3°%)和半連續(xù)發(fā)酵（發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)利用較低的G/YE (2.5°%/0.3°%)，當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束的時(shí)候，額外的葡萄糖（2.5°%)是在穩(wěn)定期內(nèi)分

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五次留加完成的，每次間隔五小時(shí)）相比，兩階段發(fā)酵都優(yōu)于間歇發(fā)酵和半連續(xù)發(fā) 酵[17]。

這樣不論是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期還是在穩(wěn)定期都分別創(chuàng)造了合適的微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)膠 環(huán)境，發(fā)酵過(guò)程中分別出現(xiàn)了較快的微生物生長(zhǎng)和較高的黃原膠產(chǎn)率，同時(shí) Yang-Ming Lo為了確定是否僅有G/YE是影響發(fā)酵的重要因素還是是否酵母浸粉的 濃度也是局定因素。另外一個(gè)兩階段試驗(yàn)：培養(yǎng)基中G/YE是1.5%/0.18%，但是G/YE 與G/YE為2.5%/0.3%是相同的。當(dāng)微生物進(jìn)入穩(wěn)定期以后，一次性流加額外的3.5% 的葡萄糖從而為發(fā)酵環(huán)境創(chuàng)造一個(gè)較高的G/YE (5.0%/0.18%)。結(jié)果顯示菌體生長(zhǎng) 速率和黃原膠產(chǎn)率與較高濃度時(shí)的酵母浸粉發(fā)酵相比都要低，較低的黃原膠產(chǎn)率是 由于進(jìn)入穩(wěn)定期后較低的菌體濃度造成的。很明顯，單獨(dú)的G/YE并不能決定黃原膠 發(fā)酵，也需要培養(yǎng)基中酵母浸粉濃度保持在一個(gè)合適的水平[17]。

因此本實(shí)驗(yàn)黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵，剛開(kāi)始葡萄糖濃度為22.2 g/L, 24 h時(shí)后一次 流加額外的剩余葡萄糖（整個(gè)過(guò)程中保持與前期實(shí)驗(yàn)中碳源含量不變)，從而為發(fā)酵 提供了兩個(gè)合適的環(huán)境：一個(gè)是微生物生長(zhǎng)，另一個(gè)是黃原膠合成，與傳統(tǒng)的間歇 發(fā)酵相比優(yōu)勢(shì)更加明顯。

4.2實(shí)驗(yàn)材料與方法

4.2.1菌種

同2.2.1

4.2.2實(shí)驗(yàn)儀器

同 2.2.2

4.2.3培養(yǎng)基及補(bǔ)料方法

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖（剛開(kāi)始22.2 g/L，24 h時(shí)一次流加額外的22.2 g/L)，豆粉 8 g/L，CaCO3 3 g/L，初始 pH 7.3。

為了保持與前期實(shí)驗(yàn)中碳源含量不變，因此40 g的淀粉完全水解理論生成的葡 萄糖為44.4 g，轉(zhuǎn)化公式為：純淀粉通過(guò)完全水解，因有水解增重的關(guān)系，每100 g

39

淀粉能生成111.11 g葡萄糖，如下面反應(yīng)式所表示：（C5HiQ〇5)n+nH2〇—nC6Hi2〇6, 因此葡萄糖的理論收率為111.11%。

4.2.4實(shí)驗(yàn)及生物反應(yīng)器運(yùn)行條件

同 2.2.4

4.2.5分析方法及原理

同2.2.5方法

4.2.6反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu) 

 

最大葉片式槳（MB)

 

新型氣體分布器

40

 

4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

4.3.1補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝對(duì)發(fā)酵液中微生物量的影響

 

圖4.1 XG-101菌株不同碳氮比下的生長(zhǎng)曲線 Fig.4.1 The growth curve of XG-101

I.W.sutherland研究認(rèn)為，對(duì)于好氣菌來(lái)說(shuō)，高氧量和低C/N比值促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)， 相對(duì)低的氧量和高C/N比值則利于胞外多糖合成。

如圖4.1所示：發(fā)酵剛開(kāi)始的36小時(shí)中，菌體的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的間歇發(fā)酵， 但從圖4.2的數(shù)據(jù)看出：在黃原膠發(fā)酵的初期，補(bǔ)料分批發(fā)膠中的黃原膠產(chǎn)量要低于 傳統(tǒng)的間歇發(fā)酵，這是因?yàn)辄S原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中，前期的的C/N比值較低， 更有利于黃單胞菌的生長(zhǎng)繁殖。因此，黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵的初期，MB攪拌體系中 的高氧量和低C/N比值促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，其中補(bǔ)料分批發(fā)酵體系，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束 的時(shí)候，OD值高達(dá)1.22,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的發(fā)酵體系，野油菜黃單胞桿菌為好氧細(xì)菌， 所以氧氣對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)和生產(chǎn)黃原膠來(lái)說(shuō)是必需的。通常發(fā)酵液中的溶氧濃度影響 到黃原膠產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)速率、黃原膠的生成率以及黃原膠的質(zhì)量，因此，高濃度細(xì) 菌隨著黃原膠發(fā)酵的進(jìn)行，黃單胞桿菌胞外的黃原膠不斷的積累，導(dǎo)致發(fā)酵液粘度 不斷增大，體積傳質(zhì)系數(shù)降低，造成供氧能力逐漸下降，高濃度的微生物需要大量 的溶氧來(lái)維持其正常的新陳代謝，但發(fā)酵后期溶氧水平的下降直接導(dǎo)致黃原膠發(fā)酵

41

質(zhì)量和產(chǎn)量的下降，如圖4.4中看到的隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，黃原膠平均分子質(zhì)量達(dá) 到最高點(diǎn)后有所下降。由此可以看出，前期較低的C/N比值雖然可以得到較高的微 生物量，為后期獲得較高的生產(chǎn)速率得到保障，但其后期對(duì)高氧量的需求造成的溶 氧水平的下降，直接導(dǎo)致微生物產(chǎn)生胞外多糖體系對(duì)氧需求的正常平衡的打破，從 而導(dǎo)致了發(fā)酵后期黃原膠產(chǎn)量和質(zhì)量的急劇下降。

(Is)蟹蠢軾

 

0102030405060708090100 110

發(fā)酵時(shí)間(h)

4.3.2補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝對(duì)發(fā)酵液中黃原膠濃度的影響

圖4.2發(fā)酵液中黃原膠濃度隨時(shí)間的變化 Fig.4.2 Relationship between xanthan concentration and fermentation time

I.W.sutherland研究認(rèn)為，對(duì)于好氣菌來(lái)說(shuō)，高氧量和低C/N比值促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)， 相對(duì)低的氧量和高C/N比值則利于胞外多糖合成。Garcia-Ochoa、Schweickart和

Quinlan也普遍認(rèn)為較高的氮源濃度對(duì)于較快的微生物生長(zhǎng)和較高的微生物濃度是有 利的[16]，然而較高的碳源濃度對(duì)于黃原膠的合成更加有利。

黃原膠屬次生代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物的合成是在菌體濃度接近或達(dá)到最高后才開(kāi) 始的[28]。黃原膠發(fā)酵過(guò)程初期表現(xiàn)為低粘度的牛頓體系，隨著胞外多糖不斷的形成 和積累，發(fā)酵液粘度逐漸的增大，在后期呈現(xiàn)為高粘度的假塑性非牛頓體系，限制 了氧的傳遞和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，影響黃原膠產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。

如圖4.2所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，黃原膠濃度不斷的增加，隨著黃單胞桿

42

菌胞外多糖的不斷積累，溶氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞變得困難起來(lái)，黃原膠產(chǎn)生速率開(kāi) 始下降，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到84小時(shí)，黃原膠產(chǎn)率變化不再明顯。發(fā)酵的前24小時(shí)，此 期間為黃單胞桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體的繁殖和生長(zhǎng)占主導(dǎo)，因此三種不同攪拌體 系下的黃原膠濃度差別不明顯，發(fā)酵時(shí)間24小時(shí)之后，由于一次流加額外葡萄糖導(dǎo) 致碳源濃度的瞬間增加，發(fā)酵液中的C/N比值達(dá)到較高，有利于產(chǎn)物黃原膠的形成， 因此，黃原膠間歇發(fā)酵與黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中后期相比，發(fā)酵液中黃原膠濃 度差別越來(lái)越大，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)間歇發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵所得到的黃原膠濃度為2.96 g/100mL、3.28 g/100mL。

4.3.3補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝對(duì)發(fā)酵液中黃原膠粘度的影響

 

圖4.3發(fā)酵液黏度隨時(shí)間的變化 Fig 4.3 Relationship between viscosity and fermentation time

通常黃原膠發(fā)酵液的粘度與黃原膠的濃度、平均分子量之間有著正相關(guān)的關(guān)系。 對(duì)照?qǐng)D4.2和圖4.4可以看出，黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵下，發(fā)酵液中黃原膠濃度的增加 與其平均分子質(zhì)量的增加均高于傳統(tǒng)間歇發(fā)酵，根據(jù)黃原膠發(fā)酵液粘度與黃原膠濃 度、平均分子質(zhì)量間的正相關(guān)關(guān)系，只有在平均分子質(zhì)量相近的條件下，黃原膠發(fā) 酵液的粘度才會(huì)隨其濃度的增加而增加。如圖4.3所示黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵所得黃原 膠發(fā)酵液的粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)間歇發(fā)酵所得黃原膠發(fā)酵液的粘度。

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Fig.4.4 Relationship between xanthan gum average molecular weight and fermentation time

正如圖4.4所示，黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵所得黃原膠質(zhì)量明顯優(yōu)于傳統(tǒng)間歇發(fā)酵所 得黃原膠質(zhì)量，最終其平均分子質(zhì)量高達(dá)：1.78x1〇7g/mol，而間歇發(fā)酵下最終所得 黃原膠平均分子質(zhì)量分別為：1.36X107 g/mol。黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵和黃原膠間歇發(fā) 酵所得黃原膠平均分子量均在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)達(dá)到最大值：1.88407 g/mol、 1.48X107 g/mol，其后隨著發(fā)酵的進(jìn)行，黃原膠平均分子質(zhì)量一直下降，結(jié)果與I.S.Suh 和II-Soon Suh的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合[3_4]。

4.3.5補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝對(duì)丙酮酸功能基團(tuán)含量的影響

張禹等研究發(fā)現(xiàn)C/N對(duì)發(fā)酵速度、發(fā)酵周期有重要的影響，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始， 采用較高的C/N (大約50: 1)促進(jìn)黃原膠的合成。同一批黃原膠發(fā)酵周期的延長(zhǎng)， 丙酮酸含量不斷的增加。因此，C/N通過(guò)控制生長(zhǎng)速度將其作用傳遞給丙酮酸的合 成[15]。

隨著微生物胞外多糖的積累，發(fā)酵液中的粘度變得越來(lái)越大，當(dāng)黃原膠濃度超 過(guò)20 g/L時(shí)，傳統(tǒng)間歇發(fā)酵下發(fā)酵罐的四周開(kāi)始出現(xiàn)停滯區(qū)，停滯區(qū)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和 溶氧的運(yùn)輸幾乎停止，導(dǎo)致黃原膠發(fā)酵質(zhì)量下降：平均分子質(zhì)量下降、分子量分布

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系數(shù)增大以及丙酮酸功能基團(tuán)含量降低，而MB發(fā)酵體系中幾乎不存在停滯區(qū)，因 此MB發(fā)酵體系下不論是間歇發(fā)酵還是補(bǔ)料分批發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中，都不存在停滯 區(qū)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：黃原膠補(bǔ)料分批下發(fā)酵所得丙酮酸功能基團(tuán)含量為4.37%，而傳 統(tǒng)的間歇發(fā)酵下所得丙酮酸功能基團(tuán)含量為5.3%。分析其主要原因?yàn)椋狠^高的微生 物需要消耗較高的溶氧，而溶氧在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)于微生物合成的黃原膠分子中丙酮 酸含量的多少有著直接的關(guān)系，同時(shí)，黃原膠分子量的增加程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于丙酮酸含 量的增加程度，因此導(dǎo)致間歇發(fā)酵中雖然其平均分子質(zhì)量低，但是其丙酮酸含量高。

M. Papagianni研究表明在發(fā)酵的72小時(shí)，對(duì)于不同攪拌速度（100 r/min?600 r/min)下，利用HPLC對(duì)其丙酮含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其隨著攪拌速度的提高而增加，眾 所周知，黃單胞桿菌發(fā)酵合成黃原膠的工程基礎(chǔ)研究，丙酮酸含量主要依賴菌株和培養(yǎng)基的選擇[6]。Peters提出了微生物對(duì)氧的需 求和丙酮酸含量?jī)烧咧g存在著直接的聯(lián)系：較高的速度將會(huì)提高溶氧水平，而丙 酮酸依賴氧的供給，從而解釋了在較高的攪拌轉(zhuǎn)速下得到較高的丙酮酸含量[7]。本實(shí) 驗(yàn)結(jié)果也顯示：雖然發(fā)酵前期較低的C/N比值可以獲得較高的微生物量，但是對(duì)于 后期黃原膠分子中的丙酮酸含量卻產(chǎn)生一定的影響。

4.3.6補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝對(duì)發(fā)酵液中碳源濃度的影響

 

Fig.4.5 Relationship between glucose concentration and fermentation time

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在任何微生物發(fā)酵過(guò)程中，根據(jù)生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，當(dāng)發(fā)酵液中的底物下降 到一定濃度時(shí)，菌體代謝速率非常緩慢，在工業(yè)生產(chǎn)中可以結(jié)束發(fā)酵。黃原膠補(bǔ)料 分批發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵的剛開(kāi)始，加入的葡萄糖的量?jī)H僅為22.2 g/L,當(dāng)微生物生長(zhǎng) 繁殖結(jié)束的時(shí)候（24 h)，一次性流加額外的葡萄糖22.2 g/L。讓黃原膠發(fā)酵的前期 保持較低的C/N比值，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，發(fā)酵進(jìn)行到24 h時(shí)，即微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期結(jié)束，額外流加的22.2 g/L葡萄糖，是發(fā)酵液中后期保持了較高的C/N比值，有 利于黃原膠的合成。

如圖4.5所示，實(shí)驗(yàn)中黃原膠發(fā)酵結(jié)束時(shí)，黃原膠間歇發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵中的 葡萄糖含量分別為1.2 g/100mL和0.37 g/100mL。碳源一部分用來(lái)構(gòu)成細(xì)胞成分， 一部分維持正常的新陳代謝，另外一部分用于目的產(chǎn)物的合成，補(bǔ)料分批發(fā)酵下的 發(fā)酵液中殘?zhí)呛棵黠@低于間歇發(fā)酵下發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮?，這些一部分用來(lái)維持 微生物正常的新陳代謝，另外，就是用來(lái)合成黃原膠，正如圖4.2所示，補(bǔ)料分批發(fā) 酵所得黃原膠產(chǎn)量比間歇發(fā)酵所得黃原膠產(chǎn)量高很多。

4.4結(jié)論

1、上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵，提供了兩個(gè)合適的環(huán)境：一個(gè)是微生物生 長(zhǎng)，另一個(gè)是黃原膠合成，與傳統(tǒng)的間歇發(fā)酵相比優(yōu)勢(shì)更加明顯。

2、補(bǔ)料分批發(fā)酵前后C/N的變化不僅僅滿足了微生物的生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)提高 了底物碳源的轉(zhuǎn)化率，增加了發(fā)酵液中黃原膠的濃度，提高了黃原膠的發(fā)酵質(zhì)量（黃 原膠平均分子質(zhì)量和丙酮酸功能基團(tuán)的含量），減少了最終發(fā)酵液中碳源的殘留量。

3、在MB攪拌體系下，不論是黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵還是間歇發(fā)酵都可以可以獲 得較高的傳質(zhì)系數(shù)、較好的宏觀穩(wěn)定流型，發(fā)酵過(guò)程中MB體系推動(dòng)了更大范圍的 液體，尤其值得一提的是，MB體系下發(fā)酵幾乎不存在滯留區(qū)，這不僅提高了最終 黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量，更重要的是提高了黃原膠的發(fā)酵質(zhì)量。

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5總結(jié)與展望

5.1全文總結(jié)

黃原膠發(fā)酵過(guò)程的中后期，隨著黃原膠濃度的提高，發(fā)酵液粘度迅速上升，黃單胞桿菌發(fā)酵合成黃原膠的工程基礎(chǔ)研究，并 體現(xiàn)出強(qiáng)烈的假塑性，造成發(fā)酵液傳質(zhì)、傳熱效率嚴(yán)重下降，并出現(xiàn)混合上的死區(qū)。 這種情況的存在影響了黃原膠產(chǎn)品的產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量，提高了發(fā)酵和分離成本，影 響了產(chǎn)品的應(yīng)用，成為阻礙黃原膠生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展一個(gè)必須解決的關(guān)鍵因素。另外， 目前國(guó)內(nèi)黃原膠生產(chǎn)大多采用一次加料的間歇發(fā)酵工藝，這種工藝沒(méi)有考慮發(fā)酵過(guò) 程中菌體增殖和黃原膠合成兩個(gè)階段對(duì)底物的不同要求，同樣也對(duì)最終產(chǎn)品的產(chǎn)量 和質(zhì)量產(chǎn)生了不利影響。

針對(duì)以上情況，本文采用30L機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，從以下三個(gè)方面對(duì)黃原 膠發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了研究，得出如下結(jié)論：

一、研究結(jié)果表明，P2DTD+6BM和MB攪拌體系在保持好的徑向氣體分散能力 的同時(shí)，加強(qiáng)了軸向循環(huán)混合的能力，明顯改善了反應(yīng)器內(nèi)部混合狀態(tài)，具有以下 明顯的優(yōu)點(diǎn)：

1、上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了冷模實(shí)驗(yàn)下的結(jié)論：P2DTD+6BM和MB體系具有較高的氣 含率和XLa值。

2、在P2DTD+6BM和MB體系下發(fā)酵較高的傳質(zhì)系數(shù)、較好的宏觀穩(wěn)定流型， 提高了底物淀粉的轉(zhuǎn)化率，增加了發(fā)酵液中黃原膠的濃度，減少了最終發(fā)酵液中淀 粉的殘留量。

3、P2DTD+6BM體系下發(fā)酵推動(dòng)了更大范圍的液體，降低了靜止區(qū)的厚度，尤 其值得一提的是，MB體系下發(fā)酵幾乎不存在滯留區(qū)，P2DTD+6BM和MB體系下不 僅提高了最終黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量，更重要的是提高了黃原膠的發(fā)酵質(zhì)量（黃原膠平均 分子質(zhì)量和丙酮酸功能基團(tuán)的含量）。

二、在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將MB應(yīng)用于黃原膠發(fā)酵中做進(jìn)一步研究。利用實(shí)驗(yàn) 室30 L發(fā)酵罐，在對(duì)pH控制的前提下，對(duì)黃單胞桿菌XG-101的黃原膠間歇生產(chǎn)和

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生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)酵在一系列的攪拌速度（140 r/min?260 r/min)下進(jìn)行，結(jié) 果顯示：

1、隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)參數(shù)分別增加，同時(shí)，黃原膠在發(fā) 酵過(guò)程中的形成也與微生物的生長(zhǎng)有一定的關(guān)系。

2、菌體生長(zhǎng)曲線隨發(fā)酵時(shí)間不斷上升，在36小時(shí)，分別進(jìn)入穩(wěn)定期，轉(zhuǎn)速為 200 r/min的菌體濃度比轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)的菌體濃度要高，并且隨著轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增 加260 r/min時(shí)兩個(gè)相差不再明顯。

3、結(jié)果也顯示隨著轉(zhuǎn)速的增加，較高轉(zhuǎn)速下的發(fā)酵體系微生物穩(wěn)定期相對(duì)較 長(zhǎng)，另一方面也說(shuō)明較高的轉(zhuǎn)速具有較高的溶氧水平，與華璟薇研究結(jié)果一致：發(fā) 酵液中的溶氧濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)速率影響不大，但是對(duì)菌體濃度達(dá)到最大之后的菌體 的穩(wěn)定期的長(zhǎng)短卻有著明顯的影響。

4、本研究通過(guò)新型氣體分布器與傳統(tǒng)環(huán)狀分布器的比較發(fā)現(xiàn)，黃單胞桿菌發(fā)酵合成黃原膠的工程基礎(chǔ)研究，改進(jìn)的新型氣體 分布器來(lái)改變?nèi)苎?，使分散出的氣體盡可能小，不僅可以延長(zhǎng)氣體在發(fā)酵液中的滯 留時(shí)間，同時(shí)加大了氣液接觸面積，從而增加溶氧推動(dòng)力，這對(duì)于反應(yīng)器內(nèi)部構(gòu)件 的優(yōu)化和黃原膠發(fā)酵質(zhì)量的提高最具有重要的意義，同時(shí)，為其他行業(yè)中高粘體系 的發(fā)酵提供了理論指導(dǎo)和思路。

三、在黃原膠發(fā)酵的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束階段，進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的研究，并 與一次投料的間歇發(fā)酵進(jìn)行了對(duì)比。研究結(jié)果表明：

1、實(shí)驗(yàn)按照發(fā)酵過(guò)程的特點(diǎn)，在菌種增殖和黃原膠合成兩個(gè)階段分別采用相應(yīng) 的生長(zhǎng)底物，適應(yīng)了發(fā)酵過(guò)程的需要，與傳統(tǒng)間歇發(fā)酵相比，產(chǎn)品質(zhì)量有了相應(yīng)的 提高。

2、補(bǔ)料分批發(fā)酵前后C/N的變化不僅僅滿足了微生物的生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)提高 了底物碳源的轉(zhuǎn)化率，增加了發(fā)酵液中黃原膠的濃度，提高了黃原膠的發(fā)酵質(zhì)量（黃 原膠平均分子質(zhì)量和丙酮酸功能基團(tuán)的含量），減少了最終發(fā)酵液中碳源的殘留量。

3、在MB攪拌體系下，不論是黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵還是間歇發(fā)酵都可以可以獲 得較高的傳質(zhì)系數(shù)、較好的宏觀穩(wěn)定流型，發(fā)酵過(guò)程中MB體系推動(dòng)了更大范圍的 液體，尤其值得一提的是，MB體系下發(fā)酵幾乎不存在滯留區(qū)，這不僅提高了最終 黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量，更重要的是提高了黃原膠的發(fā)酵質(zhì)量。

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5.2展望

黃原膠的中后期其發(fā)酵液中存在的高粘度、低溶氧，黃單胞桿菌發(fā)酵合成黃原膠的工程基礎(chǔ)研究，始終是困擾黃原膠生產(chǎn)的 一個(gè)問(wèn)題，間歇法發(fā)酵設(shè)備主要是生物攪拌反應(yīng)器，它是目前唯一工業(yè)化的設(shè)備。 現(xiàn)如今工業(yè)上生產(chǎn)黃原膠大都在生物反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵，因此在黃原膠發(fā)酵中后期由于 發(fā)酵液的高粘度和強(qiáng)假塑性導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)出現(xiàn)大量的死區(qū)，不僅造成發(fā)酵周期長(zhǎng)， 更重要的是導(dǎo)致黃原膠濃度低、能耗高，因此開(kāi)發(fā)新型的適用于黃原膠發(fā)酵過(guò)程的 新型生物反應(yīng)器就顯得特別重要。

反應(yīng)器的選擇主要是攪拌槳形式的選擇，本實(shí)驗(yàn)室基于解決上述問(wèn)題的基礎(chǔ)上 研究新的槳型、改變槳型組合層數(shù)、并考察反應(yīng)器內(nèi)部構(gòu)件（氣體分布器）對(duì)黃原 膠發(fā)酵的影響，開(kāi)發(fā)適合于黃原膠此類高粘性物系發(fā)酵的新型生物反應(yīng)器，將其應(yīng) 用于黃原膠發(fā)酵中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)，同時(shí)根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中微生物不同時(shí)期利用的碳 氮比不同，將MB攪拌體系運(yùn)用到黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)膠中來(lái)綜合研究，不僅僅為提 高黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量和發(fā)酵質(zhì)量（黃原膠平均分子質(zhì)量和丙酮酸功能基團(tuán)的含量）提 供理論指導(dǎo)，更重要的是對(duì)開(kāi)發(fā)一種新型的生物反應(yīng)器提供一定的基礎(chǔ)。