殼聚糖羧甲基纖維素膜的制備及預(yù)防腸粘連的實(shí)驗(yàn)研究:
殼聚糖羧甲基纖維素膜的制備及預(yù)防腸粘連的實(shí)驗(yàn)研究,制備殼聚糖羧甲基纖維素膜并探討其預(yù)防腸粘連的效果。方法:將殼聚糖和羧甲基纖維素按1: 1質(zhì)量比混 合，加入戊二醛、硫酸鋁銨雙交聯(lián)，甘油增塑后烘干成膜；測(cè)定膜的拉伸強(qiáng)度及斷裂伸長(zhǎng)率并行電鏡掃描。48只SD大鼠隨機(jī) 分成為3組(n= 16)，2組擦傷其回腸漿膜，制成腸粘連模型，于損傷部位分別包裹殼聚糖羧甲基纖維素膜、殼聚糖膜；另一組 不作處理作為對(duì)照組。術(shù)后第14天觀察各組腸粘連情況。結(jié)果：膜拉伸強(qiáng)度約為20 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率約為65%;掃描電鏡 (SEM)顯示膜表面結(jié)構(gòu)呈相互交錯(cuò)的纖維狀，表面有不規(guī)則的孔狀結(jié)構(gòu)。殼聚糖羧甲基纖維素膜組和殼聚糖膜組的粘連程 度顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。光鏡下見(jiàn)殼聚糖羧甲基纖維素膜、殼聚糖膜組炎癥反應(yīng)輕微，纖維增生不顯著；對(duì)照組粘連處 纖維組織增生活躍，局部炎癥反應(yīng)明顯。透射電鏡下見(jiàn)殼聚糖羧甲基纖維素膜組上皮細(xì)胞修復(fù)較殼聚糖膜組好，成纖維細(xì)胞 增生不明顯，對(duì)照組上皮細(xì)胞增生較慢，成纖維細(xì)胞分泌膠原功能活躍。結(jié)論：殼聚糖羧甲基纖維素膜適于術(shù)中縫合需要， 預(yù)防腸粘連效果顯著，性能優(yōu)于殼聚糖膜。
在施行腹腔、心血管、脊柱、關(guān)節(jié)及肌腱等部位 的外科手術(shù)后，普遍存在手術(shù)性粘連問(wèn)題。術(shù)后粘 連不僅會(huì)影響手術(shù)效果，還可導(dǎo)致嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā) 癥，甚至?xí)挂粋€(gè)成功手術(shù)歸于失敗，因此防止術(shù)后 粘連一直是研究者努力解決的問(wèn)題。目前國(guó)際上采
解，需二次手術(shù)取出，己逐漸被可降解吸收的隔離材 料所取代。聚乳酸雖為可降解材料，但其缺陷在于 降解產(chǎn)物呈酸性，局部蓄積易產(chǎn)生輕微無(wú)菌性炎癥，預(yù)防粘連僅為物理屏障作用[1]。殼聚糖作為天然可 降解吸收的生物材料，由于其獨(dú)特的生物相容性和 降解性目前己被廣泛用于醫(yī)藥領(lǐng)域。許多研究[2~ 4] 表明，殼聚糖不但能有效預(yù)防粘連，還可促進(jìn)正常上 皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。殼聚糖可制成不同的劑型，如凝膠、 溶液、海綿狀以及薄膜等，但其缺點(diǎn)是溶液、凝膠易 流動(dòng)，不易在局部形成較高濃度，而單純應(yīng)用殼聚糖 制成海綿狀及薄膜機(jī)械強(qiáng)度及韌性不夠。為此，我 們首次嘗試將殼聚糖和具有良好成膜性、可降解吸 收的防粘連材料羧甲基纖維素混合改性，制備能滿 足臨床需要可縫合的殼聚糖復(fù)合膜，并觀察其抗粘 連效果，為進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。
1材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料殼聚糖羧甲基纖維素膜的制備， 將硫酸鋁銨固體加入蒸餾水中，在50~ 60°C加熱下 使其溶解，配成0. 15%濃度的硫酸鋁銨溶液。將殼 聚糖固體和羧甲基纖維素固體按質(zhì)量比1 : 1用電 子分析天平稱取。先將稱取的羧甲基纖維素固體緩 慢加入硫酸鋁銨溶液中，在室溫下用磁力攪拌器快 速攪拌(20 r/min)至溶解，再緩慢加入稱取的殼聚 糖固體繼續(xù)攪拌至完全溶解配成1.5%的溶液。然 后加入甘油（終濃度為0. 8%)攪拌，再加入戊二醛 (終濃度為0.003%)充分?jǐn)嚢杈鶆?。將溶液放入?空干燥箱中脫泡(真空壓力達(dá)0. 1 MPa)至細(xì)密小氣 泡脫盡為止。按每盒10 ml標(biāo)準(zhǔn)加入5 cm x 5 cm 的不銹鋼盒中，最后放入隔水式恒溫干燥箱中在 60~ 70°C下干燥成膜。用醫(yī)用鋁鉑袋包裝密封，Y 射線60Co(2. 5 kGy，5 h)照射消毒備用。殼聚糖膜 又名粘停寧，可降解防術(shù)后粘連膜，煙臺(tái)萬(wàn)利醫(yī)用品 有限公司生產(chǎn)(產(chǎn)品批號(hào):41208122407021)。
1.2殼聚膝羧甲基纖維素膜拉伸強(qiáng)度及斷裂伸長(zhǎng) 率的測(cè)定膜寬20 mm，夾持長(zhǎng)度40 mm，拉伸速 率為20 mm/min，通過(guò)電子拉力測(cè)試機(jī)測(cè)量。按下 面公式計(jì)算:拉伸強(qiáng)度=P/ (b • d)，其中P為膜斷 裂時(shí)負(fù)荷(N)，b為膜寬度(mm)，d為膜厚度(mm); 斷裂伸長(zhǎng)率=(G- G。）/ G0X100%，其中G。為膜 初始有效長(zhǎng)度(mm) ; G為膜斷裂時(shí)測(cè)量線之間的長(zhǎng) 度( m m) 。
1.3 膜掃描電鏡(SEM)檢測(cè)用SEMS>250型掃
描電子顯微鏡觀察殼聚糖■羧甲基纖維素膜的表面 結(jié)構(gòu)形態(tài)及膜的共混相容性，所用樣品尺寸為1. 5
為 15 kV。
1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組成年SD大鼠48只，由第 二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量250~ 280 g， 雌雄不限，隨機(jī)分為3組，每組16只。
1.5實(shí)驗(yàn)方法為避免麻醉藥物及穿刺對(duì)腹腔實(shí) 驗(yàn)結(jié)果的干擾，全部動(dòng)物均用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg)股后肌肉注射麻醉。動(dòng)物麻醉后仰臥位固 定于平板上，剪除腹毛，脫毛劑脫毛，消毒術(shù)野，鋪 巾。在無(wú)菌操作下取下腹正中切口，長(zhǎng)約3 cm，打 開(kāi)腹腔后找出回盲部將其提至切口外，然后距回盲 部近端2 cm處用干紗布反復(fù)輕輕擦拭回腸前側(cè)面的 漿膜面，使?jié){膜受損(約0.5 cm x 3 cm)至表面有針尖 狀出血點(diǎn)為止，但不要造成穿孔。經(jīng)上述處理后分別 在2組大鼠創(chuàng)面覆蓋一張1 cm x 4 cm的殼聚糖■羧甲 基纖維素膜或殼聚糖膜，用S0可吸收縫合線將邊緣 固定2~ 3針;剩下一組大鼠創(chuàng)面暴露不作任何處理 作為對(duì)照組。然后將腸送回腹腔，用3^0的可吸收縫 合線縫合逐層關(guān)腹。術(shù)后動(dòng)物禁食12 h，分籠飼養(yǎng)。 術(shù)后連續(xù)3 d每天肌注慶大霉素4 U預(yù)防感染。14 d 后以同樣的麻醉方法開(kāi)腹檢驗(yàn)、取材。
1.6 各項(xiàng)指標(biāo)的觀察
1.6.1 —般情況比較2種膜在手術(shù)中的可操作 性、體內(nèi)殘留情況，動(dòng)物飼養(yǎng)存活情況。
1.6.2腸粘連情況為能更好的觀察腹腔粘連情 況，再次腹腔切口時(shí)包含原正中切口在內(nèi)的、以底朝 下的“U”型切口切開(kāi)腹腔，然后將腹壁組織瓣向上 掀起暴露腹腔。腸粘連程度參照Philips 5級(jí)分級(jí) 標(biāo)準(zhǔn)[5]，腸粘連程度為:0級(jí)，完全無(wú)粘連，回腸漿膜 面修復(fù)良好；I級(jí)，回腸與周?chē)M織少量粘連，疏松 易分，無(wú)滲血，經(jīng)處理的漿膜面同周?chē)哪c壁、系膜、 腹壁間的粘連面積占經(jīng)處理的漿膜面面積百分比< 25%; II級(jí)，殼聚糖羧甲基纖維素膜的制備及預(yù)防腸粘連的實(shí)驗(yàn)研究,回腸與周?chē)M織輕到中度粘連，腸管可 呈“ U”形，分離時(shí)局部有滲血，上述部位間的粘連百 分比為26% ~ 50%; III級(jí)，腸管與周?chē)M織廣泛粘 連，較難分離，無(wú)腸梗阻，上述部位間的粘連百分比 為51%~ 75%; IV級(jí)，腸管與周?chē)M織緊密粘連成 團(tuán)，分離困難，引起腸梗阻，上述部位間的粘連百分 比為 76% ~ 100%。
1.6.3光鏡觀察每組隨機(jī)各取3只大鼠的創(chuàng)面 部位腸管，用10%中性甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透 明、浸蠟、包埋等步驟制成5 Um石蠟切片。常規(guī)H~
cm x L5 cm，膜的表面真空噴偏白照，加速電壓E染色，觀察漿膜創(chuàng)面修復(fù)情況。
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第7期.肖海軍，等.殼聚糖羧甲基纖維素膜的制備及預(yù)防腸粘連的實(shí)驗(yàn)研宄
1.6.4電鏡觀察每組隨機(jī)各取3只大鼠的創(chuàng)面 部位腸管，用2. 5%戊二醛溶液預(yù)固定，1%鋨酸后 固定。經(jīng)系列丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂Epon812浸透、 包埋、聚合。定位后行連續(xù)超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸 鉛電子染色，PHILIPS CM-120透射電子顯微鏡下 觀察漿膜面細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS 11. 0統(tǒng)計(jì)軟件包
處理，采用x2檢驗(yàn)。
2結(jié)果
2. 1殼聚膝羧甲基纖維素膜各項(xiàng)指標(biāo)觀察拉伸 強(qiáng)度約為20 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率約為65%。掃描電 鏡顯示:膜較致密，沒(méi)有發(fā)生相分離，膜表面結(jié)構(gòu)呈 相互交錯(cuò)的纖維狀，表面有不規(guī)則的孔狀結(jié)構(gòu) (圖 1)。
圖1殼聚糖■羧甲基纖維素膜表面掃描電鏡圖 Fig 1 Chitosaitcarboxymethylcelluiose membrane by SEM ( x 2 000)
2.2術(shù)后-般情況殼聚糖膜包裹腸壁后，雖然能 縫合，但縫合線切割易拉豁，放置20~ 30 min左右 就變成凝膠狀態(tài);而殼聚審羧甲基纖維素膜包裹腸 壁后緊密黏附與漿膜創(chuàng)面，至手術(shù)完畢仍保持完整 形態(tài)，而且能用可吸收縫合線縫合。術(shù)后第3天殼 聚糖膜組動(dòng)物死亡1只，死因?yàn)槁楸孕阅c梗阻;術(shù)后 第9天對(duì)照組死亡1只，死因?yàn)閺V泛腸粘連導(dǎo)致絞 窄性腸梗阻。術(shù)后第14天開(kāi)腹觀察術(shù)區(qū)，殼聚糖膜 和殼聚糖■羧甲基纖維素膜形態(tài)己完全消失。
2.3術(shù)后腸粘連評(píng)分殼聚糖羧甲基纖維素膜 組、殼聚糖膜組的腸粘連主要屬0~ II級(jí)，對(duì)照組的 粘連主要為111~ IV級(jí)，殼聚糖羧甲基纖維素膜組、 殼聚糖膜組粘連程度明顯低于對(duì)照組(P< 0. 01)。殼聚糖羧甲基纖維素膜的制備及預(yù)防腸粘連的實(shí)驗(yàn)研究, 殼聚糖羧甲基纖維素膜組粘連程度大于I級(jí)的有2 33. 3%，殼聚糖羧甲基纖維素膜組的粘連程度略輕 于殼聚糖膜組。詳見(jiàn)表1。
表1三組動(dòng)物腸粘連分級(jí)情況 Tab 1 Results of intestinal adhesion in 3 groups
(n)
GroupN0IIIIIIV
CCM1668200
CM1546410
Control1500258
CCM: Chitosai- carboxymethylcenulose membrane; CM: Chitosan membrane
2.4光鏡觀察結(jié)果殼聚糖羧甲基纖維素膜組: 漿膜層創(chuàng)面己大部分修復(fù)或完全修復(fù)，上皮細(xì)胞連 續(xù)，少量成纖維細(xì)胞，膠原纖維疏松，組織炎癥反應(yīng) 輕微（圖2A);殼聚糖膜組:漿膜層創(chuàng)面己大部分修 復(fù)，成纖維細(xì)胞輕度増生，周?chē)心z原纖維，組織炎 癥反應(yīng)輕微（圖2B);對(duì)照組:漿膜面未修復(fù)，粘連處 纖維組織増生活躍，多量成纖維細(xì)胞及大量膠原纖 維，局部炎癥反應(yīng)明顯（圖2C)。
2. 5透射電鏡觀察結(jié)果殼聚糖羧甲基纖維素膜 組:漿膜層創(chuàng)面有上皮細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞扁平，修復(fù)的 上皮細(xì)胞接近正常，膠原分泌不活躍（圖3A，取材自 殼聚糖羧甲基纖維素膜組I級(jí)粘連的大鼠小腸)； 殼聚糖膜組:漿膜層創(chuàng)面有上皮細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞扁 平，部分細(xì)胞表面微絨毛缺失，基膜不完整，局部漿 膜下成分如膠原纖維等暴露于最上面（圖3B，取材 自殼聚糖膜組I級(jí)粘連的大鼠小腸)；對(duì)照組:漿膜 層創(chuàng)面上皮細(xì)胞完全消失，成纖維細(xì)胞和間質(zhì)處于 最表層，其周?chē)写罅磕z原纖維，成纖維細(xì)胞呈多角 形，核不規(guī)則，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)増生擴(kuò)張，高爾基體發(fā)達(dá) (圖3C，取材自對(duì)照組III級(jí)粘連的大鼠小腸)。
3討論
腸粘連主要是由于手術(shù)創(chuàng)傷、局部缺血、異物存 留、細(xì)菌感染、出血等導(dǎo)致的炎性反應(yīng)。炎癥引起血 管通透性増加，纖維蛋白原滲出，形成纖維蛋白沉 積，炎性細(xì)胞和受傷的間皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活 抑制物，導(dǎo)致纖維蛋白溶解作用降低，另外成纖維細(xì) 胞増生，分泌膠原纖維，多種因素造成永久性纖維粘 連[6]。而纖維蛋白原滲出増加和間皮細(xì)胞在腹膜粘 連形成中可能扮演重要作用，這些病理改變多發(fā)生
只，占]2. 5%，殼聚糖膜組1級(jí)以上有5只，占在腹腔術(shù)后10 d內(nèi)。因此，有學(xué)者認(rèn)為，腸粘連預(yù)
圖2各組光鏡觀察結(jié)果
防的重點(diǎn)應(yīng)放在盡量減少纖維蛋白原滲出和促進(jìn)腹膜間皮的生長(zhǎng)時(shí)期[7]
Fig 2 Results of 3 groups under microscope( I-E, x 40)
A: The wounded serosawas uninterrupted a^id almost completely renovated. There were a few fibroblasts with loose collagen and mild ikiflammatoiy; B: Most wounded seiosa was renovated, fibroblasts proliferated a little; and there was a small amount of collagen with mild inflammatory; C: The wounded serosa was not renovated. There were a large number of fibroblasts in adhesive parts with a great amount of collagen. The inflammatory was obvious
圖3各組電鏡觀察結(jié)果
Fig 3 Results of 3 groups under electron microscope( x 6 000)
A: The wounded serosa was covered by flat epithelia. Fibroblast was not active; B: The wounded serosa was covered by flat epithelia absent of microvillus and fundus membrane. Part of collagen were exposed on the surface of wounded serosa; C: The wounded serosa was covered by po¬lygonal fibroblast, without epithelia. Fibroblast was full of cytoplasm, rough endoplasmic reticulum and golgiapparatus, surrounded by largea- m ou nt of c ol la gen
殼聚糖具有抗感染、止血、抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 及機(jī)械隔離的作用，并能在體內(nèi)自動(dòng)降解，其作為預(yù) 防腹膜粘連的生物材料進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用己被逐漸重 視，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床中證實(shí)了殼聚糖凝膠具有 抗腹膜粘連的作用[2,8]。但是將殼聚糖凝膠涂布于 腔內(nèi)，隨后被降解吸收或術(shù)后引流排出，而不易在局 部形成較高的濃度，從而使其發(fā)揮作用的時(shí)間縮短， 作用強(qiáng)度減弱。將殼聚糖制成薄膜用于臨床雖然取 得了良好的效果['但從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，殼聚糖 膜放入腹腔后變成凝膠時(shí)間太快，膜形態(tài)只能維持
腹腔創(chuàng)面后，凝膠可發(fā)生流動(dòng)而迅麵于整個(gè)腹2〇~扣而，方面不利于手術(shù)操作，.另1纖很
難發(fā)揮膜的作用。為了解決上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)將殼 聚糖和羧甲基纖維素混合經(jīng)戊二醛、硫酸鋁銨雙交 聯(lián)制成的生物膜有如下優(yōu)點(diǎn):（1)具有一定的機(jī)械強(qiáng) 度。經(jīng)檢測(cè)拉伸強(qiáng)度可達(dá)20 MPa，掃描電鏡顯示膜 較致密，沒(méi)有發(fā)生相分離，膜表面結(jié)構(gòu)呈相互交錯(cuò)的 纖維狀，表明膜的強(qiáng)度得到了明顯的加強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)中手 術(shù)操作以及縫合也驗(yàn)證了其效果。（2)馬建標(biāo)等[10] 采用流延法制備殼聚糖膜，發(fā)現(xiàn)加入甘油能夠改善 膜的親水性、水通透性以及順應(yīng)性。我們?cè)谀さ闹?備過(guò)程中也加入甘油來(lái)増加膜的順應(yīng)性。經(jīng)檢測(cè)殼 聚糖羧甲基纖維素膜斷裂伸長(zhǎng)率65%，實(shí)驗(yàn)中觀察 發(fā)現(xiàn)膜在濕態(tài)下能黏附于損傷的腸壁并隨腸管的蠕 動(dòng)表現(xiàn)出良好的順應(yīng)性。（3)膜變成凝膠時(shí)間較殼 聚糖膜延長(zhǎng)，能夠在創(chuàng)面局部形成較高濃度，増加作 用強(qiáng)度。（4)創(chuàng)面完全愈合后能夠很快的降解吸收， 不會(huì)干擾腹腔內(nèi)的正常生理環(huán)境。
羧甲基纖維素同樣也具有良好的生物相容性以 及可降解吸收的特性，并有預(yù)防粘連及不干擾創(chuàng)面 愈合的作用[11，12]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，羧甲基纖維素在腹 腔中發(fā)揮抗粘連的作用是由于具有類(lèi)似于體液，如 滑膜液的黏滯性，在上皮細(xì)胞再生期間可起到“漂浮 浴T或“水化漂浮作用”，阻隔漿膜面與腹膜面從而防 止粘連的形成；削弱成纖維細(xì)胞的活性或増殖，防止 纖維蛋白沉積于受損的漿膜面;并防止纖溶酶原從 創(chuàng)傷表面的除去，増加其活化作用的有效性[12]。因 此，羧甲基纖維素加入到殼聚糖中制成的生物膜，可 充分發(fā)揮兩種生物材料不同防粘連機(jī)制的互補(bǔ)作 用。
由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，殼聚糖和羧甲基纖維素制 成的生物膜有顯著的預(yù)防粘連作用，殼聚糖羧甲基纖維素膜的制備及預(yù)防腸粘連的實(shí)驗(yàn)研究,殼聚糖羧甲基纖維素膜的制備及預(yù)防腸粘連的實(shí)驗(yàn)研究,術(shù)后腸粘連主 要屬0~ II級(jí)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與殼聚糖膜作用無(wú)明顯 差異。但殼聚糖羧甲基纖維素膜組粘連程度大于 I級(jí)的只有2只，占12. 5%，殼聚糖膜組I級(jí)以上 有5只，占33. 3%，可見(jiàn)殼聚糖羧甲基纖維素膜組 的粘連程度比殼聚糖膜組略輕。從光鏡及超微結(jié)構(gòu) 觀察來(lái)看，殼聚糖羧甲基纖維素生物膜能促使損傷 的腸壁漿膜層上皮細(xì)胞覆蓋，創(chuàng)面修復(fù)略好于殼聚 糖膜，這可能與殼聚糖羧甲基纖維素膜中殼聚糖能 促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué) 特性以及殼聚糖在局部保持較高濃度有關(guān)。
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