糖類化合物與強(qiáng)無機(jī)酸混合加熱會(huì)脫水生成糖醛或其衍生物。這種物質(zhì) 能與蒽酮、苯酚等物質(zhì)縮合并顯出顏色，常用來鑒別糖類。對(duì)輕基苯甲酸酰 肼（PAHBAH)法主要用于還原糖的測(cè)定，即分子中必需具有游離的半縮醛 羥基或具有a-羥基酮結(jié)構(gòu) 試劑及儀器：
501型超級(jí)恒溫器，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；
354 型 Multiscan Ascent 酶標(biāo)儀，芬蘭，LABSYSTEM 公司；
對(duì)經(jīng)基苯甲酸醜肼(p-Hydroxybenzoic Acid Hydrazide，PAHBAH)購自 Sigma 實(shí)驗(yàn)方法：
PAHBAH 溶液的配制：取 0.5gPAHBAH 溶于 9.5ml 的 NaOH (5%) PAHBAH法測(cè)定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別在水解管中加入〇.5g/L的Glucose 標(biāo)準(zhǔn)溶液Ofil、5jil、10^1、30[il、4〇nl，并用雙蒸水補(bǔ)至200叫。向上述水解 管中加入15O0PAHBAH溶液，再加入60〇nINaOH (5%)溶液，振蕩混勻， 在120°C加熱15min，用酶標(biāo)儀在405nm下比色。
結(jié)果與討論：
用酶標(biāo)儀測(cè)定0~0.1g/L葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3-1所示，得直線方程 y=4.268x+0.149, R2=0.9973<,
圖3-1還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
Figure 3-1 The standard curve of reductive sugar 3.2黃原膠酶活力測(cè)定方法的建立
由于黃原膠溶液的粘度很大，其分子主鏈被水解則粘度下降，因此原則 上可以用底物溶液粘度下降速度來表示酶活力的大小。但是.由于黃原膠溶 液的假塑性很強(qiáng)，準(zhǔn)確測(cè)定粘度的大小對(duì)粘度計(jì)的要很高=此外，測(cè)定粘度 所需樣品的量相對(duì)較大。
因此，采用PAHBAH方法，選擇用反應(yīng)液中還原糖數(shù)量的增加速度來表 示酶活力的大小。黃原膠發(fā)酵液于9000rpm離心15min，取上清液作為酶液 按圖3-2方法檢測(cè)其活力。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將兩組〇D5〇4差值折算成 還原糖量，再根據(jù)酶活力單位的定義，算出黃原膠酶活力。
種子培養(yǎng)基的組分為：牛肉浸裔：0.3%,酵母浸音：0.1%,蛋白胨：0.5%, 葡萄糖：1.0%,水：98.1%，pH6.8?7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：黃原膠：0.45%,葡萄糖：0.08%,蛋白胨：0.1%, 酵母浸出粉：0.1%,水：99.27%, pH7.0左右。
黃原膠固體培養(yǎng)基的組分為：瓊脂粉：2%，蛋白胨：0.1%,酵母浸出粉;
0.1%,黃原膠：0.3%,葡萄糖：0.2。/。，7K: 97.3%。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為：黃原膠：0.45%, MgS04: 0.05%, K2HP〇4: 0.25%, NaCl: 0.1%,水：99.15%, pH7.0 左右。 實(shí)驗(yàn)方法：
將活化后的黃原膠降解菌按1% (v/v)接種量接種至裝有100ml黃原膠 液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為301，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為 200rpm,培養(yǎng)過程中每間隔一定時(shí)間取樣，分別測(cè)定發(fā)酵液的〇D62()、pH值、 上清液中的還原糖含量（P-Hydroxybenzoieacidhydrazide，PAHBAH 法）及 粘度。
結(jié)果與討論：
圖3-3發(fā)酵液參數(shù)的變化
Figure 3~S Fermentation diagram
將黃原膠降解菌XT-11接種于黃原膠液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測(cè)定培養(yǎng)過 程中的細(xì)胞濃度、還原糖含量和粘度的變化，結(jié)果如圖3-3所示。由于發(fā)酵 液的配比中加入了少量的葡萄糖加快了菌株的最初生長(zhǎng)速度，當(dāng)有還原糖(葡 萄糖）存在時(shí)發(fā)酵液的粘度沒有下降，說明沒有降解酶的出現(xiàn)。'發(fā)酵一天后, 發(fā)酵液中的葡萄糖耗盡，該菌株開始分泌降解酶降解黃原膠（現(xiàn)象反映為還 原糖的生成以及發(fā)酵液表觀粘度的下降），有明顯的二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，可斷定 該酶為底物誘導(dǎo)型酶。此外，發(fā)酵液中還原糖的大量生成滯后于發(fā)酵液粘度 的大幅降低，說明最先起降解作用的是主鏈降解酶（xanthase),伴隨著還原 糖童持續(xù)升髙則說明了發(fā)酵液中側(cè)鏈降解酶（xanthan lyase)的存在。而發(fā)酵 液的pH值在發(fā)酵過程中基本保持不變，只是在發(fā)酵后期略有上升。
圖3-4發(fā)酵過程中pH隨時(shí)間的變化 Figure 3-4 Change of pH in the process of fermentation
3.4發(fā)酵條件的優(yōu)化
微生物產(chǎn)酶是個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，不同的培養(yǎng)條件直接影響菌體的 代謝，從而影響酶的產(chǎn)量，因此，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化是提高產(chǎn)酶量的 前提。
試劑與儀器：
AEG-120電子分析天平，日本，島津公司；
7901型磁力攪拌器，上海華光儀器儀表廠；
4330型pH計(jì)，英國(guó)，JENWAY公司；
對(duì)羥基苯甲酸酰肼（PAHBAH)購自Sigma, USA;
其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?nbsp;
3.4.1氮源對(duì)發(fā)酵的影響：
首先考察了氮源物質(zhì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%的7 種不同種類的氮源，培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)定菌體生物量及酶活（見表3-1)。 從表3-1中可以看出，硝酸銨發(fā)酵水平較高，而且來源容易，因此選其作為 發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源物質(zhì)。
表3-1氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響
Table 3-1 Effects of nitrogen sources on the bacterium growth and xanthase production
氮源生物量（OD620)酶活/UJ.I/1
酪蛋白0.39760
蛋白胨0.333104
尿素0.32422
硝酸銨0.452338
硫酸銨0.42161
硝酸鈉0.33855
氯化銨0.33628
3.4.2碳源對(duì)發(fā)酵的影響：
向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%的硝酸銨及1%不同種類的碳源，培養(yǎng)72小時(shí)
后，測(cè)菌體生物量及酶活，表3-2表明，葡萄糖效果最好。
表3-2碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響
Table 3-2 Effects of carbon sources on the bacterium growth and xanthase production
碳源生物量（OD620)酶活/IUU1
葡萄糖0.572m
蔗糖0,33387
D-木糖0.347217
乳糖0.452188
異麥芽糖0. 247112
海藻酸鈉0,511319
阿拉伯膠0.3380
D-果糖a 499282
D-甘露糖0.32952
棉子糖0.422245
3.4.3初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：
6-
值
PH
用HC】和NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，滅菌后用同一制備的菌懸液接 種，考察了上述優(yōu)化確定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別為6、6.5、7、7.5和8 時(shí)發(fā)酵液的黃原膠酶活性及菌體密度，結(jié)果顯示（圖3-5)初始pH 7.0時(shí)發(fā) 酵液產(chǎn)生的黃原膠酶活性最高，菌體密度也達(dá)到最大，因此發(fā)酵過程應(yīng)該在 中性條件下進(jìn)行。
圖3-5 pH對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響
Figure 3-5 The effects of pH on the growth and enzyme production
3.4.4通氣量對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：
在250mL三角瓶中分別加入不同體積的培養(yǎng)基，各接1%種子液，在 30°C，pH 7.0, 200 r/min培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)定各發(fā)酵液的酶活及菌體密度。 結(jié)果顯示（圖3-6)，搖瓶裝液量為30mL時(shí)其發(fā)酵液的酶活以及菌體生物量 達(dá)到最髙，因此可以確定最佳搖瓶裝液量為30mL。
圖3-6通氣量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)嗨的影響
Figure 3-6 The effects of aeration on the growth and enzyme production
3.4.5溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)黃原膠酶的影晌：
分別考察了 25°C、30°C、35°C培養(yǎng)溫度下發(fā)酵液黃原膠酶活力隨時(shí)間的 變化規(guī)律，其他發(fā)酵條件為：搖瓶裝量為30mL，初始pH為7.0,接種量為]%, 搖速為200r/min。結(jié)果可知（圖3-7)在發(fā)酵溫度為3(TC時(shí)酶活最高。
3.4.6溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響：
分別考察了 25°C、3(TC、35"C培養(yǎng)溫度下發(fā)酵液菌體密度隨時(shí)間的變化 規(guī)律，其他發(fā)酵條件為：搖瓶裝量為30mJU初始pH為7.0,接種量為1%， 搖速為200 結(jié)果可知（圖3-8)在發(fā)酵溫度為304C時(shí)可獲得最大菌體 量。
3.4.7底物濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)黃原膠酶的影晌：
考察了底物濃度分別為0.5%、1%、1.5%時(shí)發(fā)酵液黃原膠酶活力隨時(shí)間 的變化規(guī)律，其他發(fā)酵條件為：搖瓶裝量為30mL,初始pH為7.0,接種量 為1%,搖速為200 r/min。結(jié)果可知（圖3-9)在底物濃度為1°/〇時(shí)酶活最高。
按不同接種量將不同種齡的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，?24h的種 子產(chǎn)酶較髙，而接種量的影響不大。
3.4,10菌株XT-11產(chǎn)黃原膠酶的正交試驗(yàn):
根據(jù)搖瓶中單因子試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)確定XT-11 發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件。根據(jù)正交試驗(yàn)分析(如表3_3), XT-11菌株產(chǎn)酶的最佳 條件是：培養(yǎng)溫度309C，起始pH為7,底物濃度為1%。其中影響最大的是 生長(zhǎng)溫度，其次是底物濃度與裝瓶量，pH影響最小。
表3-3正交試驗(yàn)結(jié)果
Table 3-3 Result of orthorhombic testing
實(shí)驗(yàn)組溫度(°c)pH裝童（mL)底物濃度酶活力OJ/mL)
1256300.50%0.3145
2257501%0. 4227
3258751.50%0. 4578
4306751%0. 5031
5307301.50%0. 4557
6308500.50%0, 3698
7356501.50%0.30]
8357750.50%0.3145
9358301%0. 2944
K】1.221. 151.091.03—
K21.331.19L091.22—
K30.911. 121.281.21—
R0.420.070.190.19—
3.S黃原膠寡糠的制備
多聚糖降解制備寡糖的方法主要有三種，即化學(xué)降解法[2]、物理降解法[3] 和生物酶降解法[4]。化學(xué)法由于不易控制，降解產(chǎn)物為價(jià)值不大的單糖，得 不到所需的低分子量寡糖，且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，己逐漸被淘汰。物理降解法
主要是利用電磁輻射使糖苷健斷裂而產(chǎn)生低聚糖，它需要有一套具有髙輻射 強(qiáng)度的電離輻射設(shè)備和相應(yīng)的防護(hù)設(shè)施，目前僅處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，實(shí)際 應(yīng)用具有一定的局限性。酶降解法具有反應(yīng)條件溫和，寡糖得率高，不造成 環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。它不僅可以獲得低聚寡糖，而且容曷控制寡糖的聚合度， 是低聚糖制備的方向。 試劑與儀器：
對(duì)羥基苯甲酸酰肼（PAHBAH)購自Sigma, USA;
其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/div>
4330型pH計(jì)，英國(guó)，JENWAY公司；
GL-21M髙速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)廠；
QHZ-98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；
BIOSTAT發(fā)酵罐，德國(guó)，Heidolph公司
實(shí)驗(yàn)方法：
將培養(yǎng)3-4天的發(fā)酵液（以培養(yǎng)液的粘度大幅度降低為根據(jù))在9000rpm， 41：條件下離心15分鐘以除去菌體，留上清液備用。黃原膠溶于磷酸鹽緩沖 液（60mmol/L，pH=5.9 )中配成2%Xanthan Gum潛液。將上清液作為粗酶 液與2%Xanthan Gum溶液于30"C恒溫?fù)u床中保溫酶解。選取不同的時(shí)間終 止酶解反應(yīng)，測(cè)溶液粘度、生物量、還原糖三項(xiàng)指標(biāo)。在9000ipm，4T：條件 下離心15分鐘以除去菌體，用Sevag法除去蛋白[SI,經(jīng)乙醇洗滌后濃縮凍干 可得粗寡糖。
結(jié)果與討論：
為了確保降解充分，首先選取粗酶液與底物濃度5: 1的比例進(jìn)行反應(yīng)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖 >】丨），24小時(shí)底物粘度下降98%,同時(shí)還原糖含量達(dá)到最高， 而菌體密度在降解的過程中隨時(shí)間的推移不斷的增長(zhǎng)。
圖3-〗]黃原膠降解參數(shù)曲線I Figure 3-11 Diagram curve of xanthan degrading I
在對(duì)第一次酶解參數(shù)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，對(duì)粗酶液與底物濃度的配比進(jìn) 行了調(diào)整，降低到了 1: 1進(jìn)行第二次酶解分析。第二次酶解結(jié)果（如圖M2) 顯示出了與第一次相類似的特性。42小時(shí)底物粘度下降99%以上，同時(shí)還原 糖含量達(dá)到高峰，菌體密度隨著酶解的進(jìn)行不斷增長(zhǎng)?？梢?，在第二次酶解 條件下，雖然酶解時(shí)間增長(zhǎng)了近一倍，但卻大大節(jié)省了酶液的用量，因此這 個(gè)條件更有利于黃原膠寡糖的制備。