將土樣懸浮于滅菌后的生理鹽水中，并進(jìn)行梯度系列稀釋后，按常規(guī)方 法涂黃原膠平板，于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。分別挑出單個菌落的一部 分接種于黃原膠平板，于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，作為保留菌種；另一部 分接種于選擇性液體培養(yǎng)基，并于30°C振蕩培養(yǎng)(200r/min)，觀察培養(yǎng)基的 粘度變化。經(jīng)對培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液下降程度和速度的比較，選出一株對黃原 膠降解能力最強的菌落作為研究用菌，命名為XT-11[1]。

2.2分泌黃原膠酶菌株的常規(guī)鑒定

細(xì)菌的常規(guī)鑒定法，在著重于細(xì)菌的表觀特征描述的基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué) 分類、數(shù)值分類等各個方面進(jìn)行鑒定。用于進(jìn)行鑒定的菌株首先必須為純菌。 通常所說的純菌，一般是菌落形態(tài)一致、菌體細(xì)胞形態(tài)一致的菌株。其次要 求菌種必須生長代謝活躍，處于休眠或衰退的菌種則不適于此種鑒定。雖然 細(xì)菌的常規(guī)鑒定方法比較傳統(tǒng)，耗費的時間較長，同時檢測項目較多，比較 復(fù)雜，但由于該方法能從多個方面對細(xì)菌進(jìn)行分析，故一直被用來進(jìn)行細(xì)菌 鑒定。

2.2.1形態(tài)特征

試驗方法：

采用革蘭氏染色，待鑒定菌株于黃原膠液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)12?36小 時，光學(xué)顯微鏡下觀察個體形態(tài)并測定菌體大小。同時用上述培養(yǎng)物，采用 電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)、鞭毛著生情況和細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)；于牛肉膏瓊脂、 營養(yǎng)瓊脂、LB瓊脂、蛋白胨酵母音瓊脂等4種固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48

小時后觀察菌落的顏色和形態(tài)并測定菌落大小[2’'

結(jié)果與討論：

對分離到一株能夠分泌降解黃原膠酶的菌株XT-11，在光學(xué)顯微鏡下觀 察發(fā)現(xiàn)(圖2-1)，該菌株在幼齡時期為桿菌，大小約為0.4M)加111>^0~2邶!11， 呈直桿形或稍彎曲，但在1周以上的培養(yǎng)物中，只存在〇.5nmx〇.5pm左右的 類球狀細(xì)胞。負(fù)染電鏡照片顯示其側(cè)生鞭毛（圖2-2)。革蘭氏染色陰性，抗 酸性染色陰性。

XT-11菌株于固體平板培養(yǎng)基上3CTC培養(yǎng)>4天，菌落呈圓形，凸起， 較光滑，乳白色，濕潤，不透明，邊緣完整。

圖2-1 XT-11桿狀與球狀菌體形態(tài)圖2-2 XT-11的負(fù)染電鏡掃描照片

Figure 2-1 Rod and round cell of strain XT-11

Figure 2-2 Electron micrograph of negative-stained XT-11 cell

■2.2.2運動性試驗 試驗方法：

運動性檢査采用兩種方法進(jìn)行。一種是在檢査葡萄糖氧化發(fā)酵試驗時， 通過半固體穿刺同時進(jìn)行，另一種通過水浸片法檢查[4】。水浸片法具體操作 如下：在LB液體培養(yǎng)基中將XT-11菌株于30T：振蕩(150r/min)培養(yǎng)24小時 后，取1滴菌懸液置于載玻片上，加蓋蓋玻片后直接在高倍鏡下觀察^«觀察到

快速移動的菌體則表明待測菌株具有運動能力。

結(jié)果與討論r

XT-11菌株屬于兼性厭氧菌，按Cappuccino的方法w，在整個瓊脂試管 中基本呈均勻生長；半固體穿刺培養(yǎng)和懸滴鏡檢結(jié)果表明該菌體無運動性。

2.2.3生長條件試驗

試驗方法：

用721型分光光度計在660 nm處測量最適鹽濃度、最適溫度和最適pH 等的生長情況。

結(jié)果與討論：

XT-11菌株僅能在40 mg/L以下濃度的NaCl上生長；其生長溫度范圍為

12。035 °C，最適生長溫度為30 其生長的pH范圍為4-8,最適pH為

2.2.4芽孢試驗 試驗方法：

采用水浴80 保溫10 min或用與培養(yǎng)液等量的95%乙醇于20 °C保溫 45 min的處理方法檢驗芽孢是否存在。

結(jié)果與討論：

經(jīng)水浴80°C保溫lOmin或乙醇處理后，XT-11菌株不能生長，說明無芽

孢生成。 2.2.5碳源的利用 試驗方法：

硫酸銨2mg/L，磷酸二氫鈉5mg/L,磷酸氫二鉀0.5mg/L,七水合硫酸鎂

0.2 mg/L,氯化鈣0.1 mg/L。分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、D-半乳 糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊

糖、纖維二糖、D-巖藻糖，并使終濃度為20 mg/L,觀察測定菌株是否生長。 結(jié)果與討論：

XT-11菌株可以利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-木糖、 D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊糖、纖維二糖、 D-巖藻糖，其既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣。

2.2.6生理生化特征

試驗方法：

在營養(yǎng)瓊脂上，于3(TC活化培養(yǎng)24小時后，按文獻(xiàn)所述方法[2’3]，對該 培養(yǎng)物分別進(jìn)行葡萄糖氧化發(fā)酵、檸樣酸鹽利用、脲酶、卵磷脂水解、還原 硝酸鹽、產(chǎn)吲哚、甲基紅（M.R)、產(chǎn)H2S、明膠液化、七葉苷水解、厭氧生 長及淀粉水解等生理生化試驗。

結(jié)果與討論：

1)XT-11菌株的氧化酶反應(yīng)為陰性，而過氧化氫酶反應(yīng)為陽性；不呈現(xiàn) 卵磷脂酶和脲酶活性。

2)XT-11菌不能水解淀粉、纖維素、七葉苷、酪素、明膠和油脂，但能 夠分解果膠；甲基紅試驗陽性，石蕊牛奶反應(yīng)為暗紅色產(chǎn)酸；能夠由色 氨酸生成吲哚并且能夠產(chǎn)生硫化氫；硝酸鹽還原呈陰性反應(yīng)。對半乳糖、 乳糖、蔗糖和葡萄糖的氧化發(fā)酵實驗檢測發(fā)現(xiàn)，

3)7CT-11菌對上述各種糖均屬發(fā)酵型代謝。

4)XT-11菌不能利用檸檬酸鹽，在以葡萄糖為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基 上也不能生長。

2.3分泌黃原膠酶菌株的BIOLOG-GP鑒定

早在七十年代中期，一些國外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細(xì)菌 的新方法。這些技術(shù)的應(yīng)用，為微生物檢驗工作提供了一個簡便、科學(xué)的鑒

定程序，大大提高了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。目前，微生物編碼鑒定技術(shù)已經(jīng)得 到普遍應(yīng)用，并早己商品化和形成獨特的不同細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。如API、 Enterotube和BIOLOG-GP等系統(tǒng)。微生物鑒定的自動化技術(shù)近十幾年得到了 'ft速發(fā)展。目前自動化微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)己在世界范圍內(nèi)微生物分 析實驗室中得到了廣泛應(yīng)用。

BIOLOG-GP細(xì)菌鑒定系統(tǒng)通過在一塊鑒定板上使用95種碳源進(jìn)行實驗 (如圖2-3)。微生物利用碳源進(jìn)行呼吸時，會將四嗤類氧化還原染色劑，從 無色還原成紫色，從而在微生物的鑒定板上形成該微生物特征性的反應(yīng)模式 或“指紋”，通過纖維光學(xué)讀取設(shè)備一一讀數(shù)儀來讀取顏色變化，由于對光密 度的吸收值的差異，計算機通過概率最大模擬法，并將該反應(yīng)模式或“指紋” 與數(shù)據(jù)庫相比較，將目標(biāo)微生物與數(shù)據(jù)庫的相關(guān)菌的特征數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，對 分析的微生物進(jìn)行最大限度的匹配，可以在瞬間得到鑒定結(jié)果，確定所分析 的微生物的屬名或種名[5]。利用天津市出入境檢驗檢疫局BIOLOG 4.2細(xì)菌自 動鑒定分析系統(tǒng)，對黃原膠降解菌株XT-1I進(jìn)行了檢測。