鹽酸米諾環(huán)素是新一代半合成的四環(huán)素類(lèi)藥 物，其抗菌活性大于四環(huán)素可用于牙周病的治 療。目前鹽酸米諾環(huán)素用于治療牙周炎的制劑僅有 派麗奧(鹽酸米諾環(huán)素軟膏)上市?？谇徽掣浇o藥的 形式尤其適合洽療牙周炎等口腔局部疾病'可增大口腔局部的藥物濃度。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法采用 非線性數(shù)學(xué)模型擬合，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以 提高實(shí)驗(yàn)精度，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值，近年來(lái)已廣 泛用于優(yōu)化制劑處方i藝等叱本文用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效 應(yīng)面法對(duì)鹽酸米諾環(huán)素口腔貼片處方進(jìn)行優(yōu)化設(shè) 計(jì)，并最終篩選出優(yōu)化處方。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料AG245型電子天平(Mettler-Toledo 公司）;單沖壓片機(jī)（國(guó)藥龍立）;ZRS-8G智能溶出
儀(天津天大天發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；自制粘附力 測(cè)定裝置。鹽酸米諾環(huán)素(華北制藥股份有限公司， 批號(hào):20080129);MCC PH302(日本旭化成，批號(hào)： 20080414);羧甲基纖維素鈉 FSH6( CMC-Na FSH6); 交聯(lián)羧甲基纖維素鈉；卞波姆974PNF(Carbopol 974PNF);硬脂酸鎂;微粉-膠;鱗酸二氫鉀、磷酸氫 二鈉、氯化鈉均為分析純;重蒸水。應(yīng)用軟件SAS 8.2 和 Origin 7.5。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1處方工藝研究處方以CMC-NaFSH6和 Carbopd 974PNF作為鹽酸米諾環(huán)素口腔貼片的粘 附基質(zhì)，同時(shí)調(diào)節(jié)藥物釋放速率；以交聯(lián)羧甲基纖 維素鈉(CCMC-Na)為崩解劑;分別以硬脂酸鎂和微 粉桂膠作為潤(rùn)滑劑和助流劑，用微晶纖維素(MCC PH302)作稀釋劑。
制備工藝：采用粉末直接壓片法制得規(guī)格為 5 mg的鹽酸米諾環(huán)素口腔貼片。將主藥與輔料分 別過(guò)100目和80目篩，等量遞加混勻后，加入脂鎂 和微粉硅膠，再過(guò)60目篩3次，所得粉末直接壓 片。每片重50 mg。
1_2_2評(píng)價(jià)指標(biāo)及測(cè)定方法 1.2.2.1釋放度：吸收波長(zhǎng)的確定:稱取適量的鹽 酸米諾環(huán)素，用人工唾液配成濃度為20 pg/mL的溶 液，在200~400 run區(qū)間UV掃描，根據(jù)結(jié)果選擇檢 測(cè)波長(zhǎng)為349 nm,且空白輔料在此波長(zhǎng)處不干擾其 UV測(cè)定（圖1)。
圖1鹽酸米諾環(huán)素(左)及其空白輔料(右)的UV掃描圖譜 Fig 1 The ultraviolet scanning spectrum of minocycline hydrochlo ride and its blank solution
標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取25 mg鹽酸米諾環(huán)素于 100 mL量瓶中，加入人工唾液溶解稀釋定容到刻度， 得貯備液;精密量取1 mL,用人工唾液稀釋定容到 25 mL，得到10 pg/mL的對(duì)照品溶液;分別量取鹽酸 米諾環(huán)素貯備液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、3.0 mL, 分別用人工唾液稀釋定容到25 mL,在349 mn下 (圖1標(biāo)箭頭處)測(cè)定各濃度溶液的吸收度。結(jié)果表 明，鹽酸米諾環(huán)素在1?30 pg/mL濃度范圍內(nèi)，線性 關(guān)系良好，r =0.999 8。
釋放度測(cè)定條件：以500 mL人工唾液為釋放 介質(zhì)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為lOOr/min,采用沉降籃法測(cè)定其 釋放度。分別在l、2、3h取溶出液5mL,再續(xù)補(bǔ)5 mL溶出介質(zhì),樣品濾過(guò)后在349 run條件下測(cè)定其 UV吸收值。
1.2.2.2粘附力：自制粘附力測(cè)定裝置(圖2)。測(cè)定 前，先通過(guò)調(diào)節(jié)右側(cè)容器內(nèi)水量使天平平衡，稱量 右側(cè)水和容器重量m„( g ),取一貼片，精密吸取6 |JLL 水潤(rùn)濕其中一面，30 S后用鑷子將潤(rùn)濕面貼于玻璃 板上，并將200 g砝碼自然垂直壓置于片上，保持 2.5 min,再用毛細(xì)管吸取適量萬(wàn)能膠水，涂于貼片 涂層面，立即將升降臺(tái)置于天平左側(cè)砝碼的正下 方，此時(shí)，貼片上方與左側(cè)技碼下壁應(yīng)正好接觸，天 平處于平衡狀態(tài)，放置10 s,使貼片上方與砝碼下表 面粘貼上，最后用輸液裝置向右側(cè)容器中勻速加 水，速度約為20 mL/min,直至貼片與玻璃板分離， 此時(shí)稱量右側(cè)物體質(zhì)量為m(g),粘附力即為m- m〇。
1.2.2.3 口腔粘附時(shí)間：每批樣品選取健康志愿者 6人，介于20?25歲之間，將粘附片貼于齒齦，記錄 貼片脫落時(shí)間，取均值，并記錄過(guò)程中藥片殘留量 和受試者的癥狀，如是否有不舒適、口感差、口干、 唾液分泌增加、說(shuō)話困難、刺激性、黏膜傷害等癥 狀。同一受試者需在2d后才可進(jìn)行第2次試驗(yàn)吒 1.2.3星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方影響口腔貼 片質(zhì)量?jī)蓚€(gè)最主要指標(biāo)是其釋放度和粘附力。選取粘 附緩釋材料 CMC-Na FSH6 和 Carbopol 974PNF 的 用量(X, mg，X2 mg)丨崩解劑CCMC-Na用量(X3 mg) 為3個(gè)自變量作為影響口腔貼片質(zhì)量的3個(gè)主要因 素;1、2、3 h釋放度Y3%)和粘附力(Y4g) 為因變量，用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方，篩選出 合適的處方組成。各因素水平代碼和具體物理量見(jiàn) 表1，星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表1自變量水平表
Tab 1 Independent variables and tbeir correspondent values
因素水平
-1.732-10+1+1.732
X,246810
x212345
X30.511.522.5
表2
Tab 2星點(diǎn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Central composite design factors and response
序號(hào)x2x3Y,Y2Y3Y4
1-1-1-178.9591.5295.332.94
21-1-136.6265.5789.6984.5
3-11-128.7351.9772.3745.46
411-120.8345.1871.49138.18
5-1-11104.55104.76103.2178.94
61-1155.6393.0799.1394.80
7-11136.3666.0283.3352.18
811124.8547.8182.89133.38
9-1.7320099.5698.1198.4332.52
101.7320017.9653.0772,37131.46
110-1.732086.4198.0896.6934.06
1201.732014.5538.6461.82100.56
1300-1.73221.3654.7775.68117.04
14001.73223.4156.8272.95109.02
1500028.6453.1871.82110.82
1600031.3652.2783.6499.56
1700031.8258.1879.55107.96
1800030.4567.2779.09108.32
1900027.2764.0980.45127.86
2000033.6453.1879.31107.66
2結(jié)果
2.1模型擬合用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件,以評(píng)價(jià)指標(biāo)
分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二次、三次多項(xiàng) 式方程擬合，模型的優(yōu)度通過(guò)復(fù)相關(guān)系數(shù)和方差分 析來(lái)判定。對(duì)4個(gè)考察指標(biāo)的多元線性回歸方程與 二項(xiàng)式、三項(xiàng)式方程進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二項(xiàng)式方程擬 合相關(guān)系數(shù)r均大于0.9,擬合度較好；同時(shí)二項(xiàng)式 方程的/>值均小于0.05,可信度好,故選用二項(xiàng)式 方程(表3)。
表3二項(xiàng)式擬合結(jié)果
Tab 3 Results of second-order quadratic model
二次項(xiàng)擬合結(jié)果Pr
Y,=291.27693-45.67744X,-72.57737XZ+<0.00010.9728
1.93138X,2+5.65551XJ2+4.8298XX,X2
0.00080.9465
YF167.055440.0283一
Y4= -108.27075+23.71882X.+57.88015 X^l 1-65917 X220.00020.9585
2.2效應(yīng)面優(yōu)化和評(píng)估本實(shí)驗(yàn)欲制得在口腔內(nèi) 3h釋放的口腔貼片，并且l、2、3h釋放度分別達(dá) (40±10)%、(70± 10)%和 90%以上，粘附力大于 50 g。
根據(jù)模型擬合得到的多項(xiàng)式方程，應(yīng)用Origin 7.5軟件分別繪制各指標(biāo)與因素的三維效應(yīng)面（圖 3、圖4、圖5)和二維等高線圖(圖6)。將鹽酸米諾環(huán) 素口腔貼片各釋放時(shí)間點(diǎn)二維等髙線最佳釋放區(qū) 域的重疊區(qū)域與粘附力二維等高線重疊，找出交叉 區(qū)域，即為最佳處方區(qū)域。由圖6可知，各時(shí)間點(diǎn)釋 放度與粘附力的效應(yīng)面二維等高線的交集區(qū)域?yàn)?最佳處方區(qū)域，即A陰影區(qū)。
8 ,
CMC-Na/mg 1〇 1
圖3 1 h釋放度與CMC-Na和carbopol用量的效應(yīng)面關(guān)系圖 Fig 3 Responses surfaces of 1 h cumulative release (Yi%) with
圖4 2h釋放度與CMC-Na和carbopol用置的效應(yīng)面關(guān)系圖 Fig 4 Responses surfaces of 2 h cumulative release (Y2%) with CMC-Na and carbopol
圖5粘附力與CMC-Na和carbopol用置的效應(yīng)面關(guān)系圖 Fig 5 Responses surfaces of bioadhesive force (Y4 g) with CMC-Na and carbopol
2.3處方驗(yàn)證由A區(qū)預(yù)測(cè)的最佳處方中，CMC- Na FSH6 和 carbopol 974PNF 用量分別為 3.0 mg 和 3.5 mgD按照“1.2.1”項(xiàng)下制備工藝壓制3批處方，按 照“1.2.2”項(xiàng)下測(cè)定其釋放度及粘附力等指標(biāo)?？疾?其口腔粘附時(shí)間，口腔在約1 h后可感覺(jué)到輕微的 苦味?？疾旖Y(jié)果見(jiàn)表4。
表4 3批樣品的各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
Tab 4 Results of dependent variables of samples from three batches
批號(hào)Ih釋放度
2h3h粘附力/ g口腔粘附
時(shí)間/h
134.7668.7294.96_ 54.352.9
240.3874.56102.1962.813.2
336.4270.849B.0267.463.1
3討論
星點(diǎn)設(shè)計(jì)是多因素5水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在二水 平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加上極值點(diǎn)和中心點(diǎn)構(gòu)成，其 代碼分別為±l、±a和0,±a為極值,0為中值。在預(yù) 實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各因素水平的極大值+ot和極小 值-at,±1、0水平的安排遵循任意兩個(gè)物理量之間 的差值與對(duì)應(yīng)代碼之間的差值成等比的原則氣效 應(yīng)面優(yōu)化法就是通過(guò)擬合效應(yīng)變量對(duì)考察因素變 量的效應(yīng)面，即函數(shù)/可以用某一數(shù)學(xué)模型/近似 地模擬函數(shù)，依據(jù)該模型可以描繪效應(yīng)面,從效應(yīng) 面上選擇最優(yōu)的效應(yīng)域，利用/求得自變量XbX2，..., X„取值范圍即最佳實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化法^
口腔貼片在口腔黏膜上的粘附時(shí)間在3 h左右 比較適合臨床應(yīng)用，如果粘附時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)造成黏 膜潰瘍,而且可能隨進(jìn)食將藥片吞咽，影響藥效發(fā) 揮因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了 3 h釋放的口腔貼片。
本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化鹽酸米諾 環(huán)素口腔貼片處方，考察因素為緩釋材料CMC-Na FSH6和生物粘附材料Carbopol 974PNF,以及崩解 劑CCMC-Na的用量，并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定每個(gè)因素 的5個(gè)水平?？疾斓?個(gè)指標(biāo)分別為1、2、3 h的釋 放度和片劑的生物粘附力。經(jīng)比較,本實(shí)驗(yàn)的較優(yōu) 擬合結(jié)果為二次項(xiàng)擬合。選取置信水平為90%時(shí)， 各指標(biāo)的擬合方程中均未納人X3變量，說(shuō)明X3對(duì) 各指標(biāo)的影響甚微，可以忽略。因此X3取值可直接 選定為其取值范圍的中值，即1.5 mg。指標(biāo)Y3的二 次項(xiàng)擬合方程中未納人任何變量，說(shuō)明3h的釋放 與各變量關(guān)系不大，因此在選擇最佳區(qū)域時(shí)，忽略 Y3對(duì)最佳區(qū)域的限制,只需考慮其他3個(gè)指標(biāo)對(duì)最 佳區(qū)域的貢獻(xiàn)。
根據(jù)等高線圖中的重疊部分選定優(yōu)化處方，并 進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化處方的各時(shí)間點(diǎn)釋 放度和粘附力均可達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。因此，本實(shí)驗(yàn)建 立的模型具有很好的可預(yù)測(cè)性。
為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)化處方的可行性，本實(shí)驗(yàn)還測(cè) 定了其在健康志愿者口腔內(nèi)的粘附時(shí)間，確保制劑 能在牙齦停留3 h左右，保證其釋藥進(jìn)程，并與實(shí)驗(yàn) 最初設(shè)計(jì)思路相符。處方在口腔內(nèi)的苦味感可通過(guò) 加人阿斯巴甜等矯味劑來(lái)掩蓋，以提高患者順應(yīng)性。
綜上所述，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法可準(zhǔn)確地預(yù)測(cè) 鹽酸米諾環(huán)素口腔貼片的優(yōu)化結(jié)果，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)設(shè) 計(jì)目的。