黃原膠是野油菜黃單孢菌以碳水化合物為主要原料，經(jīng)好氧 發(fā)酵生物工程技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)的一種用途廣泛的細菌胞黃單胞菌外多糖，在 化工、食品、醫(yī)藥、紡織、采油和化妝品等領(lǐng)域中廣泛應用，是 目前世界上生產(chǎn)規(guī)模最大且用途極為廣泛的微生物多糖[1]。紫外 線是一種使用最早、沿用最久且應用效果明顯的微生物誘變劑， 其誘變頻率高，迄今仍然是微生物育種中最常用和有效的誘變劑 之一。本論文旨在通過對黃單胞菌的紫外線誘變及紫外線-亞硝 酸鈉復合誘變，篩選獲得黃原膠產(chǎn)量較高和質(zhì)量較好的菌株，為 產(chǎn)黃原膠菌株的進一步研究和應用提供參考。

 

1實驗材料及方法1.1菌株本實驗室保存的Xcc8004野油菜黃單胞菌菌株。本實驗室從 各地采集的野油菜黃單胞菌野生菌株cam26-cam47。

 

1.2培養(yǎng)基1.2.1 NYGA培養(yǎng)基（100ML) 酵母浸膏0.3g，牛肉浸膏0.5g， 蔗糖2g，瓊脂粉1.5g，pH7.01.2.2 NYGB培養(yǎng)基（100ML) 酵母浸膏0.3g，牛肉浸膏0.5g， 蔗糖 2g， pH7.01.3出發(fā)菌株的篩選將菌株活化，接人裝有10ml滅菌NYGB培養(yǎng)基的指形瓶中， 28°C，200rpm搖床培養(yǎng)16小時。取菌液稀釋到10-5、10-6、10-7 三個濃度，用移液槍分別吸取100微升，均勻涂布在NYGA培養(yǎng)基 平板上，每個濃度涂兩個平板。28C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，觀 察平板上單菌落的形態(tài)，用游標卡尺測量單菌落的直徑，從每個 平板中選出最大的1個單菌落，測量其直徑、記錄、保藏。對來 自同一個菌株的菌落所得各新菌株，在同一平板上點板，培養(yǎng)5天， 觀察、測量單菌落的直徑，從中選出菌落直徑最大的菌株，作為 該野生菌株的標準菌株。將不同野生菌株的標準菌株在同一平板 上點板，培養(yǎng)5天，觀察平板上單菌落的形態(tài)、測量單菌落的直徑， 進行菌株間對比，確定誘變出發(fā)菌株。

 

1.4不同強度的紫外線誘變分別吸取培養(yǎng)16小時的菌液2ml置于三個無菌平皿中，開蓋， 不同距離，15W紫外燈下照射40S。誘變后的菌液10-5、10-6、10-7 稀釋涂平板，各涂兩個平板，28C恒溫培養(yǎng)3天，觀察平板上單 菌落的形態(tài)、計菌落數(shù)，從每個平板中選出較大的若干個單菌落， 測量其直徑、記錄、編號保藏。

 

1.5不同時間的紫外線誘變分別吸取培養(yǎng)16小時的菌液2ml置于三個無菌平皿中，開 蓋，用15W的紫外燈在40cm距離下分別照射不同時間。誘變后處理同上。

 

1.6紫外線-亞硝酸鈉復合誘變?nèi)∨囵B(yǎng)16小時的2ml菌液放人滅菌指形瓶中，用醋酸溶液調(diào) 節(jié)pH到4.5，加人等體積的0.07mol/L的亞硝酸鈉溶液，在28C 水浴中處理120S，調(diào)節(jié)pH到7.0,再置于無菌平皿中、開蓋，在 15W紫外燈下40cm距離處照射40S。誘變后處理同上。

 

誘變所得菌株的初篩：從每一個誘變處理的6個平板中，觀 察各個平板中菌落形狀較大、菌落比較飽滿光滑的菌落，選擇較 大的幾個菌落測量其直徑大小，挑選出菌落直徑最大的1個菌株， 點平板；將6個平板中各平板的直徑最大菌落的菌株都點接在同 一個NYGA平板上，28C培養(yǎng)5天，從該平板中選出直徑最大菌落 的1個菌株，培養(yǎng)、編號保存。

 

誘變所得菌株的復篩：將初篩得到的菌株分批進行復篩，一 批取7-8個菌株點接在同一個NYGA平板上，28C培養(yǎng)5天，觀察、 測量各菌落直徑，進行比較。選取直徑最大的2個菌落的菌株， 培養(yǎng)、保存。對各批復篩所得菌株按上述方法進行二次復篩、三 次復篩、多次復篩；直至選出幾株直徑較大菌落的菌株。

 

1.7侯選菌株的發(fā)酵培養(yǎng)1.7.1種子液搖瓶培養(yǎng)從所選菌落中挑取少量菌苔于含10mlNYGB 培養(yǎng)基的指形瓶中，28C，200rpm搖床培養(yǎng)16h。

 

1.7.2搖瓶發(fā)酵取經(jīng)過夜培養(yǎng)的菌液2.5ml接人含100mlNYGB培 養(yǎng)基的三角瓶中，28C，180rpm搖床培養(yǎng)4天。

 

1.8黃原膠的提取用移液槍吸取20ml發(fā)酵液置于50ml離心管中，在4C， 10000rpm條件下離心30min。將離心后的上清液倒人燒杯中，加 人3-7倍體積的95%乙醇，用玻璃棒攪拌，在攪拌過程中上清液 會產(chǎn)生絮狀凝聚物，帶絮狀物聚集完后取出放在干凈的平皿上。 剩余的液體通過濾紙過濾，將上清液中剩余的沉淀過濾出來，把 濾紙上的絮狀物轉(zhuǎn)移到平皿上。用乙醇多次洗滌絮狀物，然后把 裝有絮狀物的平皿放人40C烘箱中烘干，當平皿的重量不變時， 把干燥的黃原膠粉末刮下，稱量其重量。

 

2實驗結(jié)果與分析2.1出發(fā)菌株的篩選出發(fā)菌株的選擇是決定誘變效果的重要環(huán)節(jié)，長期育種的經(jīng) 驗證明，在誘變處理前下功夫選擇一株好的出發(fā)菌株是很重要的[2]。本實驗將22株野生黃單胞菌菌株分別進行平板涂布篩選，測 量長出的單菌落直徑，每個平板上選出直徑最大的菌落點板培養(yǎng)， 五天后觀察生長情況，經(jīng)多批、多次反復點板培養(yǎng)對比，將各菌 株最大單菌落的直徑列于表1。

 

表1黃單胞菌各菌株最大單菌落的直徑（mm)

 

菌株最大直徑菌株最大直徑菌株最大直徑菌株最大直徑cam262.76cam329.3cam387.86cam4413.3cam275.54cam3310.46cam398.54cam4514.6cam2813.94cam346.72cam4012.86cam4614. 16cam299.1cam356.2cam418.52cam4710.6cam3011.48cam365.56cam4213.24cam314.08cam379.22cam4310.42. 5誘變菌株的對比取各批次誘變所得菌落直徑最大的7株菌株重新編號為 46-1、46-2、46-3、46-4、46-5、46-6、46-7 (平板上簡寫為：1、 2、3、4、5、6、7)，點在同一個平板上，以便于菌株間的對比， 培養(yǎng)三天后生長情況如圖1。

 

誘變的出發(fā)菌株的選擇，主要考慮生長速度快（意味著發(fā)酵 生產(chǎn)成本低），菌膠團大（意味著黃原膠產(chǎn)量高）兩方面。從表 1可見，cam45菌株菌落直徑最大，cam46菌株菌落直徑第二大； 在觀察菌落形態(tài)時發(fā)現(xiàn)，cam46菌株菌落的菌膠團比cam45菌株 菌落的菌膠團大一些；考慮到cam46菌株與cam45菌株菌落直徑 相差不大，而cam46菌株的菌膠團較大；故選擇cam46號菌株作 為誘變育種的出發(fā)菌株。

 

2 2不同照射時間下黃單胞菌的紫外線誘變?nèi)am46菌株作為出發(fā)菌株，進行誘變育種。本實驗釆用紫 外線照射的方法進行誘變育種，由于紫外線的穿透能力不強，不 能穿透培養(yǎng)皿的皿蓋，故誘變時須打開培養(yǎng)皿在紫外燈下照射， 照射距離為40cm，各試驗組分別照射40S，80S，120S，誘變后結(jié) 果見表2。根據(jù)前人的研究經(jīng)驗，紫外線照射的致死率在70%左 右時，產(chǎn)生正突變的幾率較高，有利于進一步篩選[3]，故選擇致 死率為69.6%的照射時間80S為最佳紫外線照射時間。

 

表2不同照射時間的致死率處理時間（S)存活菌落數(shù)（個/ml)存活率（%)致死率（%)

 

405.33X10838.661.4804.20X10830.469.61202.47X10817.982.1對照組1.38X10910002.3不同照射強度下黃單胞菌的紫外線誘變紫外線照射強度與照射距離的平方成正比關(guān)系，本實驗直接 用不同的照射距離來代表不同的照射強度。取cam46菌株培養(yǎng)后， 打開培養(yǎng)皿在紫外燈下分別照射80S，設置的照射距離為20cm、 30cm、 40cm， 誘變后結(jié)果見表 3。

 

圖1誘變所得菌株初次點板對比根據(jù)圖1的菌株生長情況，淘汰生長速度慢、菌落明顯偏小 的46-5菌株，取其他菌株同時進行搖瓶發(fā)酵，測定其黃原膠產(chǎn)量。 2.6黃原膠發(fā)酵與產(chǎn)率的計算取 46-1、46-2、46-3、46-4、46-6、46-7 菌株和 Xcc8004 標 準菌株及46號出發(fā)菌株一起發(fā)酵，經(jīng)16小時液體種子培養(yǎng)后， 在每100mlNYGB培養(yǎng)基中接種2.5ml種子培養(yǎng)基，28°C，180rpm 條件下在搖床中培養(yǎng)四天。

 

取20ml發(fā)酵液置于離心管中，10000rpm離心30min，除去沉 淀后，上清液加人3-7倍體積的95%乙醇，用玻璃棒攪拌，等絮 狀沉淀不再增多后，把玻璃棒上的沉淀取下放在干凈的培養(yǎng)皿中， 發(fā)酵液通過濾紙過濾，將沉淀出來的黃原膠用乙醇洗滌后放人烘 箱中烘干至恒重，稱量其干重。Xcc8004及誘變育種所得菌株產(chǎn) 膠率見表 5。

 

表3不同照射距離的致死率距離（cm)存活菌落數(shù)（個/ml)存活率（%)致死率（%)

 

202.39X10820.379.7303.41X10828.971.1403.94X10833.466.6對照組1.18X1091000表 5 各菌株黃原膠產(chǎn)量菌株產(chǎn)膠量（g/L)菌株產(chǎn)膠量（g/L)

 

Xcc80040.446-32.01Cam462.246-42.0546-11.546-6146-21.0346-72.332.4黃單胞菌的紫外線-亞硝酸鈉復合誘變育種亞硝酸鈉誘變作用PH為4.5，終止反應時PH為6.8 [4]，進 行紫外線-亞硝酸鈉復合誘變復合誘變時，先對菌種進行亞硝酸 鈉誘變，亞硝酸鈉處理時間120S，然后將PH調(diào)至7.0終止反應， 再取2ml亞硝酸鈉處理后菌液進行紫外誘變，紫外線照射時間 40S，距離40cm，復合誘變后結(jié)果見4。

 

從上表中可以看出，黃原膠產(chǎn)量最高的46-7菌株產(chǎn)量為 2.33g/L，比出發(fā)菌株黃原膠產(chǎn)量增加了 0.13g/L，增產(chǎn)幅度為 5.9%;與本室保存的Xcc8004標準菌株相比，46-7菌株的黃原膠 產(chǎn)量提高了 4.8倍。

 

3小結(jié)和討論本文以本實驗室從野外分離出的一批黃單胞菌菌株為原始 菌株，釆用多次平板涂布方法分離出生長較快的菌株，再經(jīng)過 多次復篩，最終選擇生長較快且透明圈較大的cam46號菌株作 為誘變的出發(fā)菌株。論文釆用紫外線誘變和紫外線-亞硝酸鈉 復合誘變，通過不同照射時間、不同照射距離來改變紫外線照 射的強度和劑量，并用紫外線和亞硝酸鈉同時作用的方法提高 黃單胞菌的突變率。

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