黃原膠是由野油菜黃單胞桿菌（Xanthomonas campestris)以碳水化合物為主要底物發(fā)酵而產(chǎn)生的 酸性胞外雜多糖，為米白色或淺米黃色粉末，具有高 黏度、耐高溫、抗鹽堿及抗剪切等獨(dú)特的理化性質(zhì)， 而且無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒、食用安全、易溶于水，在水溶液中呈多聚陰離子。因此，黃原膠被廣泛用于石油 開(kāi)采、食品醫(yī)藥、陶瓷等輕化工領(lǐng)域[1-2]。野油菜黃 單胞桿菌為革蘭氏陰性好氧菌，它在發(fā)酵過(guò)程中由 于黃原膠的產(chǎn)生而使菌液變得十分黏稠[3]，發(fā)酵液 溶氧量下降，菌體的生長(zhǎng)受到限制，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。

　　

　　透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla Hemo globin，VHb ) 是透明顫菌（Vitreoscilla )在貧氧環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生的 原核細(xì)胞中的血紅蛋白基因，由146個(gè)氨基酸組成，相對(duì) 分子量15 775[4-5]。透明顫菌血紅蛋白通過(guò)增加氧 流向細(xì)胞色素末端氧化酶的量，來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)氧濃 度[6]，它能夠從分子水平上提高菌體對(duì)氧氣的利用 能力。目前，透明顫菌血紅蛋白基因（ugb)已經(jīng)被成 功克隆到多種微生物體內(nèi)，并得到了表達(dá)[7-10]。

　　

　　為了利用ugb基因的優(yōu)良特性對(duì)生產(chǎn)菌株進(jìn)行 遺傳改造，本研究旨在將含有Ugb的重組質(zhì)粒pUC- LV，轉(zhuǎn)入野油菜黃單胞桿菌中，研究ugb基因的導(dǎo)入 對(duì)黃原膠生成的影響。

　　

　　1材料與方法1.1材料1.1.1菌種和質(zhì)粒野油菜黃單胞桿菌（Xan- thomonas campestris)W12菌株，本實(shí)驗(yàn)室保存，無(wú)氨 芐抗性;質(zhì)粒pUC -LV，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，含有570 bp 的ugb基因。

　　

　　1.1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]再 生培養(yǎng)基及搖瓶試驗(yàn)培養(yǎng)基，見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12 ]。 1.1.3原生質(zhì)體制備用溶液SMM溶液5 mol/L 蔗糖,0.02 mol/L 順丁烯二酸,0.02mol/LMga2• 6H20, pH 6. 5; 4倍濃度的PAB溶液:牛肉膏1. 5 g/ L，酵母粉1. 5 g/L; SMMP溶液:4倍濃度的PAB溶 液和2倍濃度的SMM溶液等體積混合。高滲溶液:0.5 mol/L 蔗糖。

　　

　　1.2方法1.2.1質(zhì)粒的提取和純化采用文獻(xiàn)[11]的方法。

　　

　　1.2.2 黃單胞桿菌原生質(zhì)體的制備采用文獻(xiàn) [13]中的方法。

　　

　　1.2.3黃單胞桿菌原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化取制備好的 原生質(zhì)體200 !L加入10 !L質(zhì)粒，混勻后，將其放 入電擊杯中，冰浴5 min。然后，使用LN-101基因 脈沖導(dǎo)入儀進(jìn)行電擊，將電容設(shè)為20 pF，電壓設(shè)為1.8 kV,電轉(zhuǎn)化完成后,將原生質(zhì)體懸浮液倒入離心 管中，再加入800 !L高滲溶液，28C搖床 150r/min,培養(yǎng)1.5~2h。涂布于完全再生培養(yǎng)基 培養(yǎng)48 h后，將其相對(duì)應(yīng)的影印到含有氨芐西林鈉 的LB平板上，于28C培養(yǎng)2 ~3 d，觀察轉(zhuǎn)化菌的生 長(zhǎng)情況。

　　

　　1.2.4黃單胞桿菌轉(zhuǎn)化菌株的篩選菌體生長(zhǎng)后， 再挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落接到含有相同氨芐濃度的 10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在相應(yīng)溫度下，振蕩培 養(yǎng)，再次篩選長(zhǎng)勢(shì)較好的菌體進(jìn)行隨后的試驗(yàn)。

　　

　　1.2. 5轉(zhuǎn)化菌株的鑒定取100 !L菌液10 000 r/ min,離心2 min,棄上清液，加等體積TE,沸水中煮 10 min以該菌液為模板，PCR擴(kuò)增[14]。

　　

　　1.2.6搖瓶發(fā)酵及產(chǎn)膠量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12] 中的方法。

　　

　　2結(jié)果與分析2.1黃單胞桿菌的電轉(zhuǎn)化條件采用20 !F的電容，電壓在0.6 ~ 2.5 kV之間的轉(zhuǎn)化條件，對(duì)黃單胞桿菌原生質(zhì)體進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化 表1)。

　　

　　由表1可見(jiàn)，只有20 !F電容，1.8 kV的轉(zhuǎn)化條件出現(xiàn)了大量的轉(zhuǎn)化菌，其他處理的轉(zhuǎn)化效率很 低。這可能是在原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，由于 膜被局部擊穿，形成一些瞬時(shí)的孔洞，這些孔洞的大 小足以讓質(zhì)粒DNA分子進(jìn)入細(xì)胞，從而達(dá)到對(duì)受體 進(jìn)行外源DNA轉(zhuǎn)化的目的。而一些更高的電壓造 成原生質(zhì)體大批量的死亡，致使不能在再生培養(yǎng)基 上再生出細(xì)胞壁，也無(wú)法將外源DNA轉(zhuǎn)入。

　　

　　表1黃單胞桿菌原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化條件 Table 1 Condition of electroporation for protoplasm of Xanthomonas序號(hào)Serial number電容/!FElectriccapacity電壓/kV Voltage時(shí)間/ms Time轉(zhuǎn)化效率Transformationefficiency1200.61.274-2200.81.118-3201.01.512-4201.21.503-5201.51.076+6201.81.586+ +7202. 01.366+8202. 21.024-9202.50. 896-注“-”代表轉(zhuǎn)化效率很低，幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)化子；“+”代表轉(zhuǎn)化 效率適中，有一些轉(zhuǎn)化子;“ + +"代表轉(zhuǎn)化效率很高，有大量的轉(zhuǎn)化 子.

　　

　　2.2 黃單胞桿菌轉(zhuǎn)化菌株的篩選挑選500個(gè)轉(zhuǎn)化菌，在10 mL LB液體培養(yǎng)基 (含氨芐西林鈉0. 1 mg/mL)中初篩出50個(gè)轉(zhuǎn)化菌， 進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。結(jié)果，篩選出的W1、W2、W3、 W4和W5與初發(fā)菌株相比，菌落形態(tài)相同（圖1)。

　　

　　試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化的方法，可 以成功得到轉(zhuǎn)化菌，轉(zhuǎn)化菌具有氨芐抗性。

　　

　　2.3轉(zhuǎn)化菌株的PCR鑒定PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，所獲得的轉(zhuǎn)化菌株與含有 透明顫菌血紅蛋白基因的質(zhì)粒pUC-LV的PCR結(jié) 果一致，都具有570 bp的基因片段，而初發(fā)菌沒(méi)有 擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，表明透明顫菌血紅蛋白基因 ugb轉(zhuǎn)入了黃單胞桿菌中。PCR電泳圖譜如圖2。

　　

　　2.4轉(zhuǎn)化菌株黃原膠產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果以W12為對(duì)照，分別對(duì)轉(zhuǎn)化菌株W1、W2、W3、 W4和W5進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，比較初發(fā)菌株和轉(zhuǎn)化 菌株的增長(zhǎng)量。增長(zhǎng)量=(轉(zhuǎn)化菌的干重-W12的 干重)/ W12的干重，結(jié)果見(jiàn)表2。

　　

　　由表2可以看到，轉(zhuǎn)化菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生的黃原 膠均比初發(fā)菌的高，最高可達(dá)到2. 96 g/100g，增加 了近22. 19%,平均增加了 15. 91%,表明透明顫菌 血紅蛋白基因Ugb的導(dǎo)入有利于黃原膠的合成，增 加了轉(zhuǎn)化菌的黃原膠產(chǎn)量。

　　

　　表2轉(zhuǎn)化菌株的黃原膠產(chǎn)量Table 2 Yield of Xanthan gum of Xanthomonas transforments菌株Strains黃原膠產(chǎn)量（g*100g-1)

　　

　　Yield of xanthan gum增加量/%Increasing amountW122.42-W12. 8115.97W22. 8316.83W32. 7915.18W42. 9622.19W52. 659. 403結(jié)論與討論黃單胞桿菌多糖的生物合成是由多個(gè)酶參與代 謝調(diào)節(jié)的結(jié)果，產(chǎn)膠基因是1個(gè)約16 kb彼此毗鄰 的基因簇，以此為受體菌構(gòu)建工程菌提高產(chǎn)量比較 困難[15]。一些學(xué)者在對(duì)該菌進(jìn)行遺傳改造時(shí)均采 用三親本接合法[15-17]。本研究通過(guò)原生質(zhì)體電轉(zhuǎn) 化的方法，將含有ugb基因的質(zhì)粒pUC-LV轉(zhuǎn)入到 黃單胞桿菌中，通過(guò)PCR擴(kuò)增，檢測(cè)到轉(zhuǎn)化菌中含 有外源基因Ugb，表明本研究利用原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化 法得到了黃單胞桿菌的轉(zhuǎn)化菌，這種方法與三親本 接合法相比簡(jiǎn)單易行，同時(shí)也為外源基因?qū)朦S單 胞桿菌提供一個(gè)便捷、有效的方法。

　　

　　溶氧在黃原膠發(fā)酵中有著非常重要的作用，通 常發(fā)酵液中的溶氧濃度影響到黃單胞桿菌的生長(zhǎng)速 率、黃原膠的生成率以及黃原膠的質(zhì)量，因此，加強(qiáng) 菌體的氧代謝水平對(duì)黃原膠的生成具有促進(jìn)作用。 郭宏秋等[18]報(bào)道ugb基因轉(zhuǎn)入受體菌后，可以提高 轉(zhuǎn)化菌體的自身攝氧能力。本研究將ugb基因轉(zhuǎn)入 黃單胞桿菌中，搖瓶試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)化菌的黃原膠產(chǎn)量 比初發(fā)菌平均提高了 15. 91%，說(shuō)明ugb基因的導(dǎo)入 有利于黃原膠的合成。