心腦血管疾病是威脅人類健康的三大疾病之一。 現(xiàn)已證明人體血液中低密度脂蛋白濃度的升高以及 由此引起LDL在血管壁中的過氧化是動(dòng)脈粥樣硬化 (AS)等心血管病發(fā)生的主要原因，降低血液中過高 的LDL能有效地預(yù)防和阻止其發(fā)生m。纖維蛋白原 (Fib)是血液中重要的凝血因子，含量過高可能會(huì)導(dǎo) 致高粘滯血癥及各種心腦血管疾病。大幅度的清除 Fib對改善血液流變指標(biāo)、改善血液狀況和防治高 粘滯血癥具有積極作用[21。目前血液LDL凈化方法 主要包括血漿置換、膜過濾、免疫親合吸附、物 理化學(xué)吸附及肝素誘導(dǎo)沉淀等技術(shù)。目前對誘導(dǎo)沉 淀的研究多集中于類肝素物質(zhì)如磺化多糖類物質(zhì)[\ 黃原膠是甘蘭黑腐病黃單胞菌(Xanthomonas Camparis)所產(chǎn)生的-種胞外多糖，具有聚p -1，4- P比 喃型葡萄糖的主鏈以及含糖的側(cè)鏈如丙酮酸和乙酸 基因，其聚合物骨架結(jié)構(gòu)類似于纖維素，側(cè)鏈上的 葡萄糖醒酸和丙酮酸群賦予了黃原膠負(fù)電荷。整個(gè) 分子結(jié)構(gòu)中則含有大量的伯、仲醇羥基。通過羧甲基化反應(yīng)可以使所得衍生物具有大量羧基。降解黃 原膠羧甲基化衍生物應(yīng)用于血漿脂蛋白誘導(dǎo)沉淀技 術(shù)未見報(bào)道H1。

本文以黃原膠為原料，通過降解、羧甲基化研 制出新型血漿凈化劑。研究和討論了降解中酸濃 度、降解時(shí)間、降解溫度對多糖分子質(zhì)量的影響。 羧甲基化反應(yīng)中分子質(zhì)量、氫氧化鈉和氯乙酸比值 對羧甲基含量的影響。以降解黃原膠羧甲基化衍生 物為凈化劑，考察用量、凈化體系pH值對凈化效 果的影響，確定較優(yōu)的凈化條件。

1材料與方法

1.1原料與試劑

黃原膠(上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠）、新鮮豬血、 透析袋(截留分子質(zhì)量3,500，上海源聚生物科技有 限公司)、氯乙酸(AR，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑 公司）、氫氧化鈉、鹽酸、醋酸鈉、冰醋酸、乙 醇、異丙醇等試劑為市售分析純或化學(xué)純。

722分光光度計(jì)；恒溫水浴鍋(HH-2A>電動(dòng)離 心機(jī)(80-2>循環(huán)水式真空泵(SH2-D型> 真空干燥 箱(DZF-6020塑)；精密酸度計(jì)(PHS-3C型>，烏式 粘度計(jì)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1降解黃原膠的制備

取一定量的黃原膠分散于l〇〇mL乙醇溶液中， 置于250mL三口燒瓶。加人一定量的HC1，在一定 溫度下恒溫水浴，攬拌使黃原膠分散均勻，反應(yīng)停 止后抽濾再置于60弋烘箱中烘干。

1.2.2羧甲基降解黃原膠的制備【5】

取2.5g降解黃原膠加入裝有撹拌及回流冷凝裝 置的250mL三口燒瓶中，加人50mL95%異丙醇溶 液，攪拌條件下加人一定量NaOH固體粉末。于室 溫(20 下經(jīng)行堿化反應(yīng)。

1 h后在攪拌條件下緩慢加人溶有一定量氯乙酸 的異丙醇10mL，50丈水浴下反應(yīng)2h，再加人 2gNaOH粉末，反應(yīng)lh〇

反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物倒出，傾去上清液，以1:1 HC丨調(diào)節(jié)體系pH為7,再以90%乙醇清洗3次，抽 濾，于60^下烘干。

1.2.3純化處理

將干燥后的羧甲基降解黃原膠溶于去離子水后移 入透析袋中，以去離子水充分透析，直至透析液以

AgN03溶液檢驗(yàn)無cr檢出。透析液濃縮后在50弋 下真空干燥至恒重，即獲得純凈的降解黃原膠羧甲

基化衍生物。

1.2.4血漿LDL及Fib的誘導(dǎo)沉淀

以冰醋酸和醋酸鈉配制不同pH值的HAC-NaAC 緩沖溶液，同時(shí)將不同質(zhì)量的竣甲基降解黃原膠溶 解其中，獲得不同濃度不同pH值的凈化劑緩沖溶 液。取一定體積的血漿，按1:1體積比加入上述凈 化劑緩沖溶液中，體系有沉淀物形成。于3,000rpm/ min下離心分離沉淀物，取上清液分析血漿總膽固 醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇((HDL-C)、纖維蛋白 原(Fib)及血漿總蛋白質(zhì)(TP)等指標(biāo)。

1.3分析指標(biāo)與方法

13.1降解黃原膠的相對•分子質(zhì)量粘度法測定[61。 1.3.2測定產(chǎn)物羧甲基含量指示劑酸堿滴定法m。 1.3.3紅外光譜分析常規(guī)KBr壓片法。

1.3.4血漿(血清)總膽固醇濃度(CTC)乙醇抽提，磷 硫鐵顯色法[8]。

1.3.5高密度脂蛋白膽固醇濃度(CHDI^Ch)磷鎢酸鈉- Mg2+沉淀，磷硫鐵顯色法[9]。

1.3.6低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白膽固醇濃度(Ci Ch+VU3L.Ch)由計(jì)算得到：Cu>K；h+VLDL"Ch=CTC-CHDL-Co 1.3.7血漿(血清)總蛋白質(zhì)濃度(Cn〇雜脲顯色法[丨0丨。 1.3.8血漿纖維蛋白原濃度(CF,b)亞硫酸鈉沉淀-雙 縮脲顯色法[1<)1。-

1.3.9 清除百分率(RP%) RP=(CB-CA)/CB *100。

式中C為血清或血漿中TC、HDL-Ch、LDL- Ch+VLDL-Ch的濃度，mg/L;下標(biāo)A、B分別為 凈化后及凈化前。

2結(jié)果與討論

2.1降解黃原膠的制備條件優(yōu)化

以水浴降解黃原膠各單因素試驗(yàn)為依據(jù)，選擇 酸濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為考察因素，隨機(jī) 安排各因素的水平順序。并以粘度為降解結(jié)果考察 依據(jù)(見表1、表2)。

表1正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

因素123

A HC 丨濃度(mol.L“）0.100.150.20

B溫度(<C)506070

C加熱時(shí)間(h)1.01.52.0

由正交實(shí)驗(yàn)極差分析可得，各個(gè)因素對產(chǎn)物粘 度影響的大小順序?yàn)椋核釢舛?gt;反應(yīng)時(shí)間>反應(yīng)溫

 

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)號A HC1 濃度(mol，L_l)B溫度(<C)C加熱時(shí)間(h)粘度(Pa • s)

10.10501.01.62

20.10601.51.43

30.10702.01.16

40.15502.01.18

50.15601.01.25

60.15701.51.36

70.20501.51.42

80.20602.01.33

90.20701.01.44

K14.204.224.29

K23.793.744.21

K34.193.963.67

R1.040.480.63

氫氧化鈉與氯乙酸用量比對取代度的影響如圖2所示。

 

度。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件為：酸濃度為0.1 5mol • I/1， 60^下水浴加熱2h。

2.2羧甲基化實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

由于黃原膠粘度較大，過高的溫度，反應(yīng)時(shí)間 過長或反應(yīng)體系水含量較多都會(huì)使反應(yīng)物糊化結(jié) 塊，使得反應(yīng)無法進(jìn)行，所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)將反應(yīng)溫度 控制在501，并采用干法制備，直接加人固體的 氫氧化鈉[51。

2.2.1黃原膠分子質(zhì)量對羧甲基化取代度的影響 固定黃原膠用量為2.5g,氫氧化鈉用量為 10g,氯乙酸用量為10g,堿化時(shí)間lh,醚化時(shí)間 3h,二次加堿量為氫氧化鈉2g,反應(yīng)溫度50^。 黃原膠分子質(zhì)量對羧甲基取代度的影響如圖1所示。

由圖1可知，隨著黃原膠分子質(zhì)量的減小，反 應(yīng)更易進(jìn)行，所得產(chǎn)物羧甲基取代度更高，因黃原 膠原膠分子質(zhì)量較大，在一百萬左右。而降解至兩 萬以下羧甲基化反應(yīng)便可較易進(jìn)行。

2.2.2氯乙酸與氫氧化鈉用量比對羧甲基化取代度的 影響

固定黃原膠用量為2.5g，分子質(zhì)量為180,000, 堿化時(shí)間為lh,醚化時(shí)間為3h,反應(yīng)溫度為50丈，

圖2 NaOH:MCAA對取代度的影響 由圖2可知，當(dāng)氯乙酸的用量增加時(shí)，多糖分 子附近的酸濃度增大，因此羧甲基化的程度增大， 但當(dāng)氯乙酸過多會(huì)與氫氧化鈉反應(yīng)引起反應(yīng)體系溫 度迅速升高，使得部分溶劑異丙醇揮發(fā)損失，體系 中醇水比例發(fā)生改變，新生成的產(chǎn)品會(huì)很快溶脹、 結(jié)塊使反應(yīng)無法進(jìn)行，造成狻甲基取代度下降，所 以，一般取氫氧化鈉與氯乙酸的比值為2:1.8。 2.2.3降解黃原膠羧甲基化衍生物的紅外表征 .FTIR譜圖3中的l,637cm“為結(jié)合水峰，1,022 

及1，421 cm—1出現(xiàn)了-COO-的對稱和非對稱伸縮振動(dòng)蛋白凈化效果隨降解黃原膠羧甲基化衍生物濃度的 峰，表明羧甲基連接到了黃原膠分子上。變化關(guān)系。

2.3降解黃原肢羧甲基化衍生物來度和凈化體系pH 對血漿凈化效果的影響

影響LDL誘導(dǎo)沉淀的主要因素包括凈化劑濃度 和體系pH值。下面將分別考察兩者對血漿凈化效果 的影響。

2.3.1降解黃原膠羧甲基化衍生物濃度對血漿脂蛋白 凈化效果的影響

用含有不同濃度的降解黃原膠羧甲基化衍生物 的緩沖溶液，按1:丨體積比與已去除血細(xì)胞的血漿 混合進(jìn)行凈化，考察凈化劑濃度(CPA)對血漿脂蛋白 

實(shí)_驗(yàn)中觀察到，在一定pH壞境下，隨凈化劑 濃度增大，血漿TC及LDL凈化率增加。在體系 pH=5.20時(shí)，隨著凈化劑溶度增大至2,500mg/L，可 使TC下降40%左右，LDL和VLDL下降45%左右， 而對HDL的清除率小于25%，并不顯著。這是由 于LDL和HDL的載脂蛋白的種類、組成及空間結(jié) 構(gòu)存在較大差異所致。LDL的載脂蛋白為apolipopr- otein-B(Apo-B)，Apo-B富含賴氨酸、精氨酸和組氨 酸等堿性氨基酸殘基，且多暴露于載脂蛋白表面。 而 HDL 的載脂蛋白為 apolipoprotein-A(Apo-A)，亦 含有一定量的賴氨酸，但其暴露在HDL分子表面的 比率較小。HDL等電點(diǎn)低于LDL，故在相同pH環(huán) 境下，HDL所帶的正電荷比LDL少，其與聚陰離 子形成不溶性復(fù)合物的能力較LDL低。當(dāng)體系 pH=5.20近似于LDL的等電點(diǎn)時(shí)，隨著聚陰離子降 解黃原膠羧甲基化衍生物的加入，可以促使其聚 沉。另外，LDL的分子質(zhì)量及尺寸均較HDL大， 在等電點(diǎn)處更容易聚集。

此外，F(xiàn)ib是一種纖維狀蛋白質(zhì)高分子，其等 點(diǎn)電約為pH=5.5。當(dāng)體系pH值低¥其等電點(diǎn)時(shí)， Fib整體帶正電荷，容易與聚陰離子形成復(fù)合物絮 凝沉淀出來。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體系pH=5.10以及體 系pH=5.20時(shí)，凈化劑溶度分別為l,500mg/L、2,000 mg/L、2,500mg/L時(shí)，在所取上清液中加人適量的 亞硫酸鈉溶液均沒有形成沉淀，表明此時(shí)Fib的清 除率接近100%。

2.3.2凈化體系pH對血漿脂蛋白凈化效果的影響 凈化體系pH是影響凈化劑誘導(dǎo)沉淀LDL及Fib 的另一個(gè)重要因素，在凈化劑濃度一定的條件下， 改變凈化體系的pH值，考察其對血液凈化效果的影 響，結(jié)果如圖6所示。

由圖可得：隨著pH下降，TC、LDL及Fib 的清除率將提高。這是由于體系pH環(huán)境決定了血漿 蛋白質(zhì)的荷電數(shù)，故對蛋白質(zhì)與凈化劑相互作用有 重要的影響。在pH低于5.1后的HDL及TP的清除 率都較高，所以選取PH=5.20作為凈化的優(yōu)化pH 值，在此體系下可大幅度清除TC、LDL,而對TP 及HDL的清除率并不顯著。 

 

pH

圖6凈化體系pH對血漿凈化效果的影響(n=5)

2.4.3凈化效果測定體系下，對15個(gè)血漿樣本進(jìn)行凈化實(shí)驗(yàn)，凈化結(jié)

取凈化劑濃度為2,500mg/L/在pH=5.20的凈化果如表3所示。

表3降解黃原膠羧甲基化衍生物對血漿中脂蛋白的凈化效果(n=l5)

TCHDL-CLDL-CTP

凈化前(mg/dL)121.4 ± 16.340.6 ±5.180.9 ± 14.559.2 土 7.1

凈化后(mg/dL)75.1 土 10.529.9 ± 4.943.9 ± 8.850.7 土 6.7

清除率39%24%46%14%

 

3結(jié)論

以黃原膠為原料，首先進(jìn)行酸降解，再以氯乙 酸為羧甲基化試劑，對其進(jìn)行羧甲基化，可以獲得 降解黃原膠羧甲基化衍生物。通過正交實(shí)驗(yàn)得到： 降解黃原膠的優(yōu)化條件為酸濃度為〇.15mol •!/、 60T水浴加熱2h，使其分子質(zhì)量降到兩萬以下，羧 甲基化反應(yīng)的較優(yōu)條件為反應(yīng)溫度50丈，干法制 備，直接加人固體的氫氧化鈉，氫氧化鈉與氯乙酸 的比值為2:1.8。

以這種新型降解黃原膠羧甲基化衍生物為凈化 劑，研究其選擇凈化血液低密度脂蛋白(LDL)及纖 維蛋白原(Fib)的性能，得到較優(yōu)凈化條件為：體系 pH=5.20,凈化劑濃度為2,500mg/L時(shí)，可使TC下 降40%左右，LDL和VLDL下降45%，F(xiàn)ib下降接 近100%，而HDL和TP下降小于25%，無顯著變 化。說明降解黃原膠衍生物具有良好的選擇凈化性 能，是一種新型LDL/Fib凈化劑。

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