黃原膠由五糖單位重復(fù)構(gòu)成，其主鏈?zhǔn)怯蒔-1，4-糖苷鍵相連的葡萄糖鏈組成，在 主鏈結(jié)構(gòu)上每隔一分子葡萄糖連著一個由三糖組成的側(cè)鏈：甘露糖—葡萄糖^甘露糖。 其中，與主鏈相連的甘露糖大多被乙酰基和側(cè)鏈末端的甘露糖與丙酮酸發(fā)生縮醛反應(yīng)從 而被修飾，而中間的葡萄糖則被氧化為葡萄糖醒酸，分子量一般在2000 ~2_kD之間。 黃原膠除了有規(guī)則的一級結(jié)構(gòu)外，還具有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)——規(guī)則的螺旋結(jié)構(gòu)[1]。

黃原膠（xanthan gum)是人類研究最深、商業(yè)化應(yīng)用程度最高的微生物胞外多糖。 由于其獨(dú)特的剪切稀釋性質(zhì)，良好的增稠性，理想的乳化穩(wěn)定性，對酸、堿、熱、反 復(fù)凍融的高度穩(wěn)定性以及對人體的完全無毒害等許多優(yōu)良的特性，而在食品、石油、 醫(yī)藥、日用化工等十幾個領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用。超乎尋常的穩(wěn)定性極大地擴(kuò)展了 黃原膠的應(yīng)用范圍，但同時也引起了一些應(yīng)用問題。采油過程中黃原膠的使用可提高 采油率，但也增加了原油的粘度，使后續(xù)工藝如油料運(yùn)輸及產(chǎn)品純化的成本增高[2]， 為此需要能方便降解黃原膠的方法。

盡管黃原膠的主鏈結(jié)構(gòu)與纖維素相同，但由于規(guī)則的螺旋結(jié)構(gòu)的保護(hù)，以及側(cè)鏈 所產(chǎn)生的位阻，使得一般的糖水解酶如淀粉酶、纖維素酶和半纖維素酶等都很難將其 降解[3]。Rinaudo等在1980年第一次報道了用纖維素酶可以降解不規(guī)則構(gòu)象的黃原膠 主鏈，但卻幾乎完全不降解具有規(guī)則的螺旋構(gòu)象的黃原膠[4]。為了能有效降解黃原膠, Cripps等人于1981年從土壤中分離到一種能以黃原膠為唯一碳源進(jìn)行生長的棒狀桿 菌[2]，隨后陸續(xù)又有研究者又發(fā)現(xiàn)了黃原膠的降解菌株[5’6]。

最近我們從土壤中首次分離到了一株能夠使黃原膠粘度迅速下降的 菌，該菌能夠以黃原膠為唯一碳源進(jìn)行生長，并發(fā)現(xiàn)該菌具有胞外黃原膠降解酶活性。 本文主要研究了該黃原膠降解菌株的分類及降解酶的性質(zhì)，這也是國內(nèi)首次有關(guān)生物 降解法生產(chǎn)黃原膠寡糖的報道。

1材料與方法

1.1黃原膠降解菌株的篩選及鑒定

將土樣懸浮于滅菌后的生理鹽水中，并進(jìn)行梯度系列稀釋后，按常規(guī)方法涂黃原 膠平板，于30丈培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別挑出單個菌落的一部分接種于黃原膠平板， 于30T培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，作為保留菌種；另一部分接種于選擇性液體培養(yǎng)基，并于 30丈振蕩培養(yǎng)（20〇r/min),觀察培養(yǎng)基的粘度變化。

選擇性液體培養(yǎng)基組成為：黃原膠：2.5 g， (NH4)2S04 0.5 g, KH2P04 3.0 g, K2HP043.0 g, MgS04 • 7H20 0.2 g, FeCl3 • 6H20 16.7 mg, CaCl2 • 2H20 0.66 mg, ZnS04 • 7H20 0. 2 mg, CuS04 • 5H20 0. 2 mg, MnS04 • 4H20 0. 2 mg, CoCl2 • 6H20 0. 2 mg，H3B03 0• 1 mg, NaN03 2. 0 g，Na2Mo04.2H20 0. 3 mg，定容至 1 L。黃原膠平板 培養(yǎng)基的組成為：瓊脂粉：20 g，蛋白胨：1 g,酵母浸出粉：1 g,黃原膠：3 g,葡萄 糖：2 g，水：1 L。黃原膠液體培養(yǎng)基的組成為：黃原膠：4.5 g，葡萄糖：0.8 g,蛋 白胨：1 g，酵母浸出粉：1 g,調(diào)pH至7.0左右，定容至1 L。

黃原膠降解菌株的分類鑒定按《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[7]和《國際細(xì)菌分類學(xué)雜志》 進(jìn)行。

1.2培養(yǎng)

將活化后的黃原膠降解菌按1 %接種量接種至裝有100 mL黃原膠液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為30丈，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,培養(yǎng)過程中每間 隔一定時間取樣，分別測定發(fā)酵液的和上清液中的還原糖含量（P-Hydroxybenzoic acidhydrazide, PAHBAH 法[9])及粘度。

1.3降解酶的初步純化

將培養(yǎng)4 ~5 d的發(fā)酵液（以培養(yǎng)液的粘度大幅度降低為根據(jù)）在9, 000 r/min， 條件下離心15 min除去菌體，于上清液中分別加人35% ~ 80%不同飽和度的 (冊4)2304，靜置4〇111丨11，然后在900〇1'/111;11，4丈下離心2〇111111，用磷酸鹽緩沖液溶解 沉淀，分別測定酶活力。

將鹽析后所得粗酶透析12 h (換3次透析液），冷凍干燥后，再溶解于小體積的相 同緩沖液中。上事先平衡過的DEAE-Sepharose柱（pH = 5. 9)，用含有0. 7 mol/L NaCl 的相同緩沖液線性梯度洗脫（流速1 mL/min)，并收集活性組分。合并活性組分并透 析后，用冷凍干燥機(jī)濃縮，再次上DEAE-Sepharose柱（pH =4. 9),收集活性組分，透 析12 h (中間換3次透析液），濃縮成固體后-20T冷藏保存留作活性分析。

1.4酶活力分析

將一定量的酶與底物（0.25%黃原膠水溶液）混合后（酶與底物的質(zhì)量比為1:15)， pH5.9,在30丈水浴中反應(yīng)45 min，立即取200 JJLL反應(yīng)液加入到750 JJLL5%PAHBAH (汾81^)和他〇11(5%)的混合液中，在12〇<€下加熱15 111;11，用酶標(biāo)儀測定01>4〇5。

黃原膠降解酶的活力定義為每分鐘催化形成相當(dāng)于1 ^mol葡萄糖的還原末端所需 的酶量為一個酶活力單位。

1.5黃原膠降解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1. S. 1溫度對黃原膠降解酶的影響：分別在25T、30T、35丈、40T、50T下測定酶 活（PH5.9),以30丈為基準(zhǔn)（100%)。并在40^，45T, 50T下分別保溫1 h，在 30T水浴中測定酶活，以沒有保溫Oh的酶活為基準(zhǔn)（100% )。

1.S.2 pH對降解酶的影響：分別在pH 4.4、4.9、5.9、7.0、8.0、9.2下于30弋水 浴中保溫〇、1、3 h,測定酶活，以在PH5.9下保溫Oh的酶活作為基準(zhǔn)（100%)。 1.5.3金屬離子對酶活的影響以及Ca2 +對EDTA抑制作用的補(bǔ)償：在不同金屬離子存 在時測定酶活（3(TC, PH5. 9)，以沒添加金屬離子的酶活作為空白對照（100%)，除 Na+和K+為150 mol/L外，其余的金屬離子濃度皆為1 xl(T3m〇l/L。

在EDTA存在下（6xl(T4m〇l/L),加人不同量的Ca2+，測定酶活，以不含EDTA 和Ca2+的酶活為空白對照（CK，100%)。

1.5.4底物專一性的研究：分別以纖維素、淀粉、葡聚糖、木聚糖、昆布多糖、卡拉 膠（T)，卡拉膠〇〇,卡拉膠（K)[以上藥品皆為Sigma公司產(chǎn)]作為酶解底物，以 黃原膠作為底物的酶活為基準(zhǔn)（1〇〇%)，測定酶活（30^，PH5. 9)，以上黃原膠作為 底物的酶活為基準(zhǔn)（1〇〇%)。

1.5.5酶的動力學(xué)研究：（a) V-S曲線：將一定量的酶與不同濃度的底物（S)混和， 酶解時間準(zhǔn)確控制為15 min (3(rC, PH5. 9),測定還原糖的生成量，除以酶解時間作 為酶解速度（V^以V-S作圖。（b) EDTA對酶活的抑制曲線：將一定量的酶與不同 濃度的底物（S)混和，加人EDTA，使其在反應(yīng)體系的濃度為lxl(T3m〇l/L,酶解時 間準(zhǔn)確控制為15 min (30丈，PH5. 9)，測定還原糖的生成量，除以酶解時間作為酶解 速度（V)，以V-S作圖。

2結(jié)果與討論

2.1菌株的篩選與鑒定

從黃原膠平板上挑取能使選擇性液體培養(yǎng)基粘度明顯變稀所對映的菌落，在新鮮 黃原膠平板上劃線培養(yǎng)，選擇單菌落，用選擇性液體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)對培養(yǎng)過程 中培養(yǎng)液粘度下降程度和速度的比較，選出一株對黃原膠降解能力最強(qiáng)的菌落作為研 究用菌，并命名為XT11。

黃原膠降解菌XT11在細(xì)胞生長過程中呈桿狀，老齡菌為球形，黃原膠降解菌的篩選及其降解酶性質(zhì)的研究，菌體形態(tài)不規(guī)則； 不形成孢子，革蘭氏染色陽性，抗酸性陰性，且不運(yùn)動。由《伯杰細(xì)菌鑒定手冊]可 知，應(yīng)屬于纖維單胞菌屬但由于其不水解纖維素，又與已知纖維單胞菌 屬的各個種有區(qū)別，可能是屬中的一個新種。有關(guān)該菌株是否是一新種， 尚需對其16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹和DNA雜交數(shù)據(jù)分析后才能確定。

2.2發(fā)酵

將黃原膠降解菌XT11接種于黃原5.(^

膠液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測定培養(yǎng)過程丨

中的細(xì)胞濃度、還原糖含量和粘度的變3.5 - 化，結(jié)果如圖1。當(dāng)有還原糖（在發(fā)酵 液中加人了少量的葡萄糖來加快菌株的|g ^ - 最初生長速度），存在時發(fā)酵液的粘度

沒有變化，說明沒有降解酶的出現(xiàn)。發(fā) 酵2d后，發(fā)酵液中的葡萄糖耗盡，該 菌株開始分泌降解酶降解黃原膠（現(xiàn)象 反映為還原糖的生成以及發(fā)酵液表觀粘 度的下降），因此有明顯的二次生長現(xiàn) 象，并斷定該酶為誘導(dǎo)酶。此外，發(fā)酵

液中還原糖的大量生成滯后于發(fā)酵液粘度的大幅降低，說明最先被降解的應(yīng)是主鏈結(jié) 構(gòu)（xanthase)，伴隨的還原糖量持續(xù)升高則說明了發(fā)酵液中側(cè)鏈降解酶（xanthan lyase)的存在。

2.3黃原膠降解酶的部分分離純化

黃原膠降解酶分離純化的結(jié)果如表1。經(jīng)測定，45% ~65%飽和度的硫酸銨可以最 大限度地將黃原膠降解酶沉淀并除去盡可能多的雜蛋白。

表1黃原膠降解酶的純化結(jié)果

提純步驟總酶活/ (u)總蛋白量/ (mg)比活/ (u/mg)回收率/ (%)提純倍數(shù)

Crude enzyme348111231.71001

(NH4 ) 2 SO4 Precipitation2054105.319.559.011.5

DEAE-Sepharose ( pH5. 9 )

Chromatography16263.3348.446.728.5

DEAE-Sepharose ( pH4. 9 )

Chromatography ( peak 1 # )214.30.73293.56.2172.6

DEAE-Sepharose ( pH4. 9 )

Chromatography (peak 2#)333.70. 86388. 19.6228.3

在硫酸銨沉淀蛋白中仍含有相當(dāng)量的糖，由于這些糖并不掛柱，因此在第一次DE- AE-Sepharose層析時（pH5_ 9)可將其除去。在第二次DEAE-Sepharose柱層析時 (PH4. 9),從柱上洗脫出兩個具有酶活的蛋白峰（分別命名為峰1#和峰2#，圖略）。 由黃原膠的結(jié)構(gòu)推測，微生物要利用黃原膠作為碳源生長，至少應(yīng)由兩種酶共同起作 用——主鏈水解酶和側(cè)鏈水解酶，因此推測這兩個蛋白峰可能為兩種不同的降解酶， 有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。至投稿日止，我們尚未得到電泳純的黃原膠降解酶，因此本 文使用部分純化的黃原膠降解酶進(jìn)行酶學(xué)研究。

2.4酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.4.1最適酶解溫度以及溫度穩(wěn)定性：結(jié)果表明（圖2)，黃原膠降解酶的最適溫度為 30^~40^,并且，其溫度敏感性較高，在45^下保溫lh酶活力是28.6%, 50^下 保溫1 h酶活力只剩14. 6%。 2.4.2最適酶解PH以及pH穩(wěn)定性：見圖3。該酶的最適PH的范圍為5.0?7.0,但 對pH的敏感性不高，在PH9. 2時能保持57%的活性，即便在此pH下保溫3 h能保持 43%的活性。

金屬離子對酶活的影響：由結(jié)果（圖4)可知，主族的二價離子Ca2+、Mg2+對

酶活沒有影響，高濃度的主族一價離子Na+、K+對酶活有一定程度的影響，過渡金屬 離子Co2 +對酶活有一定的影響，而過渡金屬離子Hg2+、Zn2+、金屬離子螯合劑EDTA 的存在則幾乎可使其完全失活。而由Ca2+對EDTA抑制作用的補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖7) 可知，Ca2+能很大程度地緩解EDTA對酶活的抑制作用。

圖4金屬離子對酶活的影響圖5 Ca2 +對酶活的補(bǔ)償作用

可由此推測出主族的二價金屬離子（如Ca2+，Mg2+等）對于維持此酶活性的必要性： 一是直接的活性中心，二是作為輔基而起輔助性作用。正常情況下此酶中并不缺少此 類金屬離子，因此Mg2+和Ca2+的加人并不能影響酶活，而加人EDTA后，由于其螯合 了酶中的此類金屬離子而使酶活大幅降低，通過向溶液中添加Ca2+可使酶活得以恢復(fù)。 而就主族的一價金屬離子、過渡金屬離子而言，黃原膠降解菌的篩選及其降解酶性質(zhì)的研究，由于對酶中的金屬離子存在著競爭而 將其置換下來，從而導(dǎo)致酶活力不同程度的損失。

2.4.4底物專一性的研究：黃原膠降解酶具有髙度底物專一性，除黃原膠外，對其它 多糖僅有較低的降解活性，如表2所示。

表2釀的專一性研究

底物相對酶活/%底物相對酶活/%底物相對酶活/%

黃原膠100昆布多糖0果膠0

纖維素9卡拉膠（T)0巖藻聚糖4

淀粉0卡拉膠0023海藻酸鈉10

葡聚糖0卡拉膠U)5菊粉0

木聚糖0瓜膠18多聚半乳糖醛酸12

2.4. S酶的動力學(xué)研究：米氏方程以及EDTA對酶活的抑制作用：如圖6,通過繪出 V-S曲線，可得到關(guān)于此酶的如下信息：（1)米氏常數(shù)（Michaelis constant) &n = 0.26|xg/mL; (2)最大反應(yīng)速度Fmax=72(jimol/ (min*g);因此，如果該酶的動力學(xué) 方程符合 Michaelis - Menten epuation，則：

(a)當(dāng) S< </：m時，V = VWxS/Xm=277 • S

(b)當(dāng) S > 時，V = Fmax =72 (junol/ (min . g)

(c) 當(dāng) S與接近時，V = Fmax/ (尺m+S) =72/ (0.26+S)

通過有EDTA抑制時的V-S曲線可以看出，EDTA使酶對底物的/Cm明顯增大（K„ >XJ，而并無太大變化，說明EDTA可能螯合并從而占據(jù)了酶和底物的結(jié)合作用 密切相關(guān)的金屬子的位點(diǎn)，黃原膠降解菌的篩選及其降解酶性質(zhì)的研究，使得酶與底物結(jié)合的能力大大減弱，只有當(dāng)?shù)孜餄舛冗^量 時，才能恢復(fù)其原有的反應(yīng)速度。此外，如很多構(gòu)酶那樣，抑制劑（EDTA)的存在增 大了底物（黃原膠）與酶結(jié)合過程中的協(xié)同性，使V-S曲線變?yōu)槊黠@的S型，因此推 測此酶為別構(gòu)酶。

S/( 11 g/mL)

圖6無抑制的V-S曲線以及加人EDTA后的V-S曲線

3結(jié)論及展望

本文發(fā)現(xiàn)了一種新型的可分泌黃原膠降解酶的細(xì)菌，并對該酶進(jìn)行了初步的分離 純化；研究了黃原膠降解酶的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)黃原膠降解酶對溫度敏感性較高，而對 pH環(huán)境的要求則相對寬松；通過研究金屬離子對酶活性影響，以及Ca2 +對EDTA抑制 作用的補(bǔ)償作用，推測有二價的主族金屬離子作為輔助因子對酶的活性起作用；通過 研究酶反應(yīng)初速度（V)與底物濃度（S)之間的關(guān)系，以及加人抑制劑后的V-S關(guān)系 發(fā)現(xiàn)，此酶為別構(gòu)酶。而由該酶降解黃原膠所得到的寡糖的結(jié)構(gòu)、組成以及可能擁有 的生物活性，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。