黃原膠又稱為漢生膠，是一種用途廣泛的微生物胞外多糖。它無味、無臭、無毒、食用安全，是目前國際 上集增稠、懸浮、乳化、穩(wěn)定于一體，性能最優(yōu)越的生物膠[1]，在石油工業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥、化工等諸多行業(yè) 獲得了廣泛的應(yīng)用[2]。目前，國內(nèi)黃原膠發(fā)酵水平與國外先進(jìn)水平相比尚有較大差距[3]，利用何種有效的 途徑提高黃原膠的產(chǎn)量與多糖的品質(zhì)，節(jié)約生產(chǎn)成本，成為近年來黃原膠研究的主要方向[4]。
甘蔗糖蜜是糖廠的主要副產(chǎn)品，成分非常復(fù)雜并且其含糖量仍非常高，蔗糖和還原糖占30% ~50%，是 發(fā)酵、食品、飼料和建材工業(yè)中質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的原料[5]，中國是甘蔗種植大國，甘蔗糖蜜原料非常充足，用糖蜜原 料發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠，可降低成本，節(jié)約能源，具有一定的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益,實(shí)驗(yàn)通過微波對黃原膠生產(chǎn)菌進(jìn)行 誘變育種，以期得到能利用甘蔗糖蜜高效發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的優(yōu)良生產(chǎn)菌種。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1. 1. 1菌種
野油菜黃單胞菌(如―camPest心）20183,購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)。
1.1.2儀器
YP202N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司），SW - CL -2FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限 公司），GNP -9160BS - IE隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），CS101 - AB型電熱鼓風(fēng)干 燥箱（中華人民共和國重慶試驗(yàn)設(shè)備制造），K021B - BF美的微波爐（廣東美的微波爐制造有限公司），TXQ -LS - s n全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），糖用錘度計(jì)（浙江余桃儀 表二廠）。
1.1.3培養(yǎng)基
糖蜜由廣西宜州石別糖廠提供，使用前按文獻(xiàn)[6 ]處理得糖蜜酸化水解液備用;其余試劑均為分析純
試劑。
菌種活化培養(yǎng)基:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L，PH值為7.0。
菌種培養(yǎng)液:蛋白胨5 g,牛肉膏3 g，氯化鈉5 g,蒸餾水1 L,pH值為7.0。
平板培養(yǎng)基：蛋白胨5 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂15 g,8°Bx糖蜜水解液1 L，PH值為7.0。
種子培養(yǎng)液:蛋白胨8 g,磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，8°Bx糖蜜酸化水解液1 L，PH值為7.0。
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨5g，磷酸二氫鉀〇.2g,硫酸鎂0.2g，檸檬酸1 g,10°Bx糖蜜酸化水解液1 L， pH值為7.0。
1.2實(shí)驗(yàn)方法 1. 2. 1菌種活化
將保藏菌種轉(zhuǎn)接至活化培養(yǎng)基中,28尤恒溫培養(yǎng)36 h,使菌種活化，用于下一步實(shí)驗(yàn)。
1. 2. 2微波誘變實(shí)驗(yàn)
(1)活化菌株生長曲線的測定。
取斜面活化菌株一環(huán)至菌種培養(yǎng)液中，28 t、180 r/min搖床培養(yǎng)，從6 h后開始，每隔3 h取樣600 mn 測其吸光度M)值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度M)值為縱坐標(biāo)繪菌株生長曲線，根據(jù)生長曲線選擇處于對 數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)。
(2)微波誘變致死率曲線。
取10 mL處于對數(shù)生長期的菌種接人裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，并用玻璃珠振蕩，打散菌 落。使用十倍稀釋法稀釋菌懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，選取約1〇8個(gè)孢子/mL孢子菌懸液，分裝5 mL至無 菌離心管中，以900 W功率微波爐進(jìn)行輻射處理，每次照射10 s后使平皿冷卻，消除熱效應(yīng)，再進(jìn)行照射，并 將照射時(shí)間累計(jì)[7]。按照常規(guī)方法稀釋濃度梯度涂布篩選平板，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算致死率并繪畫致死曲線。
(3 )黃原膠菌株誘變突變株篩選。
根據(jù)致死率曲線，以致死率為70% ~ 80%的誘變劑量處理菌株[8]，經(jīng)過輻射后涂布平板，在28丈下培 養(yǎng)3 d，從平板上挑取大而圓的菌落接到搖瓶種子培養(yǎng)基內(nèi)，置180 r/min搖床28 t恒溫培養(yǎng)36 h，然后以 10%接種量，裝液量200 mL/500 mL三角瓶，28 t恒溫?fù)u床180 r/min培養(yǎng)72 h進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。
(4)遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
將選育出的產(chǎn)膠量最高的菌株接種于活化培養(yǎng)基上傳代，共傳六代,相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，測黃原膠產(chǎn) 膠量,檢測誘變所得黃原膠菌株的遺傳穩(wěn)定性。
1. 2. 3黃原膠提取方法[9]
將95%乙醇和發(fā)酵液按1:2比例混合，室溫下攪拌20 min,過濾，得到黃原膠沉淀置于烘箱中，60 T烘 干至恒重稱量。
2結(jié)果與分析
2.1實(shí)驗(yàn)菌株生長曲線
菌種接種到均勻的液體培養(yǎng)基后，細(xì)菌以二分裂繁殖。經(jīng)過遲緩期進(jìn)人對數(shù)生長期，并以最大的速率生 長和分裂，導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量呈對數(shù)增加，此時(shí)細(xì)菌生長呈平衡生長，即細(xì)胞內(nèi)各成分按比例有規(guī)律地增加，所有 細(xì)胞組分呈彼此相對穩(wěn)定速度合成。對數(shù)生長期細(xì)菌的代謝活性高而穩(wěn)定，細(xì)胞大小比較一致，生活力強(qiáng)， 易變異，重復(fù)性較好。由圖1可知，該菌株對數(shù)生長曲線為9 ~21 h,24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,所以選擇培養(yǎng)18 H 的菌液進(jìn)行誘變處理。
微波誘變是一種新興的物理誘變育種技術(shù)，且設(shè)備相對簡單，易于操作，安全高效。微波輻射會(huì)產(chǎn)生熱 效應(yīng)，引起生物迅速升溫并導(dǎo)致各種生物功能產(chǎn)生變化。隨著微波時(shí)間的延長，致死率逐漸增大。由圖2可 知，當(dāng)輻射時(shí)間為60 s時(shí)，致死率在70% -80%之間。根據(jù)誘變的機(jī)制，菌株的正突變幾率可能性最大，因 此選用60 s作為誘變篩選的輻射時(shí)間。
圖2微波誘變致死率曲線
2.2.2黃原膠菌株誘變突變株篩選
以單位體積發(fā)酵液黃原膠的產(chǎn)量為篩選指標(biāo)，篩選到1株黃原膠產(chǎn)量有較大提高的正突變株X12,由表 1可知，該菌株黃原膠的產(chǎn)量達(dá)到了 22. 14 g/L,是未誘變菌株的1. 53倍。
表1微波誘變后菌株的黃原膠產(chǎn)量對比
菌株編號菌株20183 (誘變前）突變株X12(誘變后）
黃原膠產(chǎn)量14 51 g/L22. 14 g/L
2.2.3遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
為檢驗(yàn)突變菌株X12發(fā)酵產(chǎn)膠的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)將突變菌株連續(xù)傳代6次，每代按初步確定的發(fā)酵條件 測定其黃原膠產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變菌株經(jīng)過微波輻射誘變后，基因發(fā)生了突變，總產(chǎn) 量得到提高且產(chǎn)量基本維持在22. 14 g/L左右，有較好的遺傳穩(wěn)定性。
表2突變菌株X12傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果
傳代次數(shù)〇123456
黃原膠產(chǎn)量22. 14g/L 22. 56 g/L22. 64 g/L19. 87g/L 21.32 ^/L20. 91 g/L21.73g/L
甘蔗糖蜜來源廣，價(jià)格低，是重要的工業(yè)發(fā)酵原料，實(shí)驗(yàn)通過微波誘變處理保藏野油菜黃單胞菌20183, 篩選到一株能以甘蔗糖蜜作為發(fā)酵原料生產(chǎn)黃原膠的優(yōu)良正突變株XI2,該菌株的黃原膠產(chǎn)量達(dá)22. 14 g/L，是未誘變菌株的1. 53倍,傳代實(shí)驗(yàn)表明，該菌株遺產(chǎn)性狀穩(wěn)定。
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