黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究,黃原膠是由野生黃單胞菌以碳水化合物為主要 底物，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種酸性胞外雜多糖[11。
黃原膠分子的基本構(gòu)成為D-葡萄糖、D-甘露 糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸以及丙酮酸w。黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究,其中前三者 的比率接近3: 3: 21”。從其分子結(jié)構(gòu)可以看出,主鏈與 纖維素基本相同，其顯著差別僅在于三糖側(cè)鏈在無水 葡萄糖單位之間交替出現(xiàn)。每兩個(gè)經(jīng)由P - 1，4 - D -
糖苷鍵連接而成的葡萄糖分子上，含有一條由一個(gè) D-葡萄糖醛酸連接兩個(gè)D-H•露糖組成的側(cè)鏈，上 面連接有乙?；捅猁}
由于黃原膠具存的獨(dú)特結(jié)構(gòu)141和優(yōu)良性能15 61,所 以被廣泛應(yīng)用于多種行業(yè)中國內(nèi)外針對黃原膠 研究的工作主要集中在菌種選育、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件、 基因X程菌構(gòu)建等諸多方面，f曰.有關(guān)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研 究仍少見報(bào)道，特別是國內(nèi)在這一方曲未曾涉足„
發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究發(fā)酵過程變量在活細(xì)胞的作用 下變化的規(guī)律，黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究,以及各種發(fā)酵條件對這些變量變化速 度的影響。在黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究中，我們主要 從兩個(gè)方面進(jìn)行，即菌體生長動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)物合成動(dòng)力 學(xué)。擬通過對這兩個(gè)過程中微生物比生長速率、基質(zhì) 消耗率、產(chǎn)物合成率、維持系數(shù)等動(dòng)態(tài)變量之關(guān)系以 及它們與發(fā)酵條件之間關(guān)系的研究，從而更加系統(tǒng)、 有效地駕馭這些發(fā)酵條件和動(dòng)態(tài)變量，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程 中的動(dòng)力學(xué)問題進(jìn)行了探索性研究，該項(xiàng)基礎(chǔ)研究可
用于提卨我國當(dāng)前黃原膠丁業(yè)化生產(chǎn)過程的控制 水平；為改善我國生產(chǎn)的現(xiàn)有黃原膠質(zhì)量提供了T.程 動(dòng)力學(xué)的調(diào)控依據(jù)。同時(shí)，也為我們后續(xù)的基因工程 的黃原膠生物合成代謝譜圖及生產(chǎn)工藝放大的研究 奠定了理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料 1. 1.1菌種
Xanthonomas campestris一9002,由本研究室保藏 菌種選育 1.1.2培養(yǎng)基
1.1.2. 1斜面培養(yǎng)基(％)
葡萄糖1.0,蛋白胨1.0,牛肉膏0.15,酵母浸出物
0.3.瓊脂2.0,pH7.0。
1.1.2.2種子培養(yǎng)基(％)
葡萄糖1.0,蛋白胨0.5,酵母浸出物0.3,牛肉膏
0.3,硫酸鎂0.01,磷酸氫二鉀0.05,碳酸鈉0.2, PH7,0:
1. 1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基(％)
葡萄糖1.0,淀粉3.0,蛋白胨0.3,酵母浸出物 0. 3，氯化鉀0. 5,磷酸氫二鉀0. 41,硫酸鎂0.01,磷酸 二氫鉀 0.069,抒檬酸 0.2,PH7.03 1.2方法
1.2.1搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)
按常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法制備種子菌液，以10%的體積 比接人發(fā)酵培養(yǎng)基中，并將發(fā)酵培養(yǎng)基的最終體積控 制在100ml,裝人500ml的二角瓶中，置往復(fù)式搖床， 發(fā)酵6011(23〇1?111,28尤）(：每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。 1.2.2發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)
種子液制備同搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。裝液量5000ml,接 種量10%,通氣量0.6L/min，轉(zhuǎn)速250/min,溫度 28 ~3(«：,發(fā)酵周期60h,取樣間隔4h,PH7.0。檢測參 數(shù):轉(zhuǎn)速、溫度、粘度、殘?zhí)?、pH和產(chǎn)膠率3 1.2.3恒化培養(yǎng)
培養(yǎng)基配方同分批培養(yǎng)。恒化培養(yǎng)開始前，先進(jìn) 行分批培養(yǎng)。培養(yǎng)基經(jīng)接種后讓菌體生長繁殖到一定 的濃度，發(fā)酵液粘度達(dá)到lOOOOcps以上時(shí)，開啟蠕動(dòng) 泵，以某一恒定速率補(bǔ)料，并連續(xù)流出樣液，保持發(fā)酵 罐內(nèi)液面恒定：當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，測定各狀態(tài)參數(shù), 調(diào)大流速進(jìn)行下一組試驗(yàn)。培養(yǎng)條件:28 ± 1^ ,35〇" min,通氣量 0. 6L/minn
恒化培養(yǎng)試驗(yàn)裝置如圖2所示。試驗(yàn)通過進(jìn)料口
處的兩只蠕動(dòng)泵來調(diào)控補(bǔ)料流量，連續(xù)從取料n取 料，以維持罐內(nèi)發(fā)酵液體積為一恒定值。
1.2.4發(fā)酵液PH值的測定
用PHs -25型PH計(jì)直接測定發(fā)酵液的pH值。
1.2.5發(fā)酵液殘?zhí)堑陌攵ㄖ脺y定
產(chǎn)）
1.2.6發(fā)酵液粘度的測定
取發(fā)酵液直接用上海天平儀器廠生產(chǎn)的- I 型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)以叫號轉(zhuǎn)了• 6r/min測定，ffl所得數(shù)據(jù) 乘以1000即為發(fā)酵液粘度5 1.2.7發(fā)酵液吸光度的測定
取發(fā)酵液稀釋后直接用72〖型分光光度計(jì)在 650nm波長下測定其吸光度。
1.2,8產(chǎn)膠率的測定
定量稱取發(fā)酵液，下業(yè)酒精沉降.50T烘至恒 1。稱最干膠重量，黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究,干膠重1與發(fā)酵液重量的比即為 產(chǎn)膠率。
1,2,9發(fā)酵液殘?zhí)堑亩繙y定(3,5—二硝基水楊酸 比色定搪法)丨18]
1,2.10細(xì)胞干重的測定
定量吸取發(fā)酵液，適當(dāng)稀釋后用事先烘干的濾紙 在大漏斗中過濾，將濾紙置于50?烘箱中烘至恒 重，稱重后換算成所需單位。
2結(jié)果與討論
2.1黃原膠分批發(fā)酵特性 2.1.1菌體生長曲線
圖3為黃原膠分批發(fā)酵過程中發(fā)酵液吸光度隨 時(shí)間的變化規(guī)律，發(fā)酵液吸光度的變化可看作是其中 菌體量的變化，故吸光度隨時(shí)間的變化曲線可看作菌 體生長曲線，體現(xiàn)發(fā)酵過程中菌體的生長情況。從生 長曲線來看，菌體的對數(shù)增長期為發(fā)酵開始12至 20h，在這一時(shí)間內(nèi)，菌體生長速度最快jOh以后進(jìn)人
發(fā)酵時(shí)間[h)
®4黃原膠發(fā)酵過程中PH的變化曲線
穩(wěn)定期，曲線呈平緩趨勢,菌體生長兒乎停止。20h后表1。 達(dá)到穩(wěn)定期是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中菌體繁殖達(dá)到平衡。
2.1.2 pH的變化
圖4為黃原膠分批發(fā)酵過程中pH隨發(fā)酵時(shí)間的 變化曲線3從曲線可看出，在發(fā)酵的初始階段PH值有 一較小的上升，這是因?yàn)榘l(fā)酵液中的一些金屬鹽類及 酸根離子所具有的緩沖作用。之后，因產(chǎn)物合成產(chǎn)酸， pH下降，直至穩(wěn)定期開始，菌體生長緩慢，pH兒乎不 再發(fā)生變化。
于新鮮培養(yǎng)基的加人造成局部濃度現(xiàn)象的發(fā)生=發(fā)酵 罐的工作體積確定為8L(其裝量系數(shù)為〇. 625)「綜合 工藝要求，選擇攪拌轉(zhuǎn)速為35〇r/min，培養(yǎng)溫度為 通氣童〇. ^L/min。連續(xù)培養(yǎng)補(bǔ)料葡萄糖溶 液濃度為30g/L„
2.3恒化培養(yǎng)穩(wěn)定狀態(tài)的確定
根據(jù)發(fā)酵液粘度及pH的變化進(jìn)行判斷，當(dāng)粘度 和pH在一較長時(shí)間內(nèi)維持穩(wěn)定時(shí)，間隔〗~ 2h取樣 測其粘度，并觀察pH變化，若2 - 3次無變化或變化 很小，即認(rèn)為系統(tǒng)已達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。
2. 4連續(xù)培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果
按上述實(shí)驗(yàn)條件和要求，以葡萄搪作為限制性基 質(zhì)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)先進(jìn)行分批培養(yǎng)，并在24h以相對 于發(fā)酵液1%的量補(bǔ)加葡萄糖一次。當(dāng)發(fā)酵液粘度升 至]8500cps時(shí)開始連續(xù)培養(yǎng)。稀釋率試驗(yàn)范圍為 0.03-0. 08h_\當(dāng)每改變一次稀釋率，進(jìn)人穩(wěn)態(tài)后分 別取樣測定殘?zhí)恰⒕鷿?、粘度和產(chǎn)膠率。試驗(yàn)結(jié)果列于
由表1可見，菌濃、產(chǎn)率、粘度、pH均隨稀釋率增 大而降低。這是因?yàn)榘l(fā)酵液濃度變稀所致。不同稀釋 率下的各參數(shù)計(jì)算值見表
表1恒化培養(yǎng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)
稀釋速率D/(f)菌濃(g/L)殘?zhí)?g/L)粘度{cps)pH產(chǎn)率(％)
0.0335.27. 830139006.352.36
0.0432.611.1188006,051.54
0- 0530.214.7053005.901.46
0.0627,019-0138005.861-22
a 〇819.831.2535005-911.12
表2不同稀釋速率下各參數(shù)的計(jì)算值
rnh-1)Yc(g/g)DX(g/L h)Qo^g/g. h)
0.030. 02741.0941.06a 0020
0,040. 0354L 1281.300.0021
0.050.04191. 1941.510.0024
0.060. 04661,2861.620. 0027
0.080.03542. 2631.580. 0045
其中；Qr. = D(S。- S)/X為底物葡萄糖比消耗速率.g/f；. h; Yc =- S),為基質(zhì)得率系數(shù),以以D/X,為黃質(zhì)K比生成速
率j/g；. h;DX為菌灃生長速軋g/L上
2.2培養(yǎng)條件的確定所致。
恒化培養(yǎng)要求發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液混合均勻，防止由2.5—9902生長模型的建立
由表2可知，隨著稀釋率的增加，基質(zhì)得率和 產(chǎn)物比生成速率都呈上升趨勢，黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究,這說明連續(xù)補(bǔ)料可 提高基質(zhì)得率，促進(jìn)產(chǎn)物生成。而底物比消耗速率 和菌體生長速率均增加到一定程度后有所下降，這 是由于體系被稀釋一定程度后菌體生長平衡被打破
0 111''
0.030.040.050.060.08
稀釋率(1/h)
+殘.+茴濃+產(chǎn)率一•_粘度
圖，不同玀釋速率T的穩(wěn)態(tài)蒗濃、產(chǎn)膠率、殘?zhí)?、粘?/div>
及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特性參數(shù)的推導(dǎo)
圖5顯示野油菜黃單胞菌連續(xù)培養(yǎng)達(dá)穩(wěn)態(tài)時(shí)菌 體濃度、黃原膠產(chǎn)率、發(fā)酵液粘度、殘?zhí)呛侩S稀 釋速率D的變化關(guān)系，從圖中可以看出，隨D的提 高，菌體濃度、發(fā)酵液粘度和產(chǎn)率均下降。由于葡 萄糖料液流人體系后有三個(gè)流向，一為菌體生長消 耗，二為產(chǎn)物合成消耗，其余隨發(fā)酵液流出。故葡 萄糖料液的不斷補(bǔ)加使體系稀釋，上述參數(shù)下降， 殘?zhí)呛吭黾印?/div>
已知 Monod 方程S/(fe+S)⑴
變形得 1/(1 = 1/和„ + Ks/p™,. 1/S⑵
穩(wěn)態(tài)時(shí)P = D,故l/)x可以1/D來代替。
由圖2-4可見l/>ftl/S成直線關(guān)系，說明野 油菜黃單胞菌的生長與限制性基質(zhì)濃度的關(guān)系符合 Mum>d方程。根據(jù)連續(xù)培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，用計(jì)算機(jī)對1/ M•和i/s進(jìn)行最小二乘回歸，求得jw=o. ism-1, L = 41. 32g/L(其相關(guān)系數(shù) R = 0. 9995)。
在連續(xù)培養(yǎng)中，對底物葡萄糖進(jìn)行物料衡算，可 以得到基質(zhì)的比消耗速率與菌的比生長速率^最 大生長得率系數(shù)Yc™'和維持系數(shù)m的關(guān)系式如下：
Q& = II/YG0"1 + tn(3)
拫據(jù)式(3),通過計(jì)算機(jī)對和p進(jìn)行線性回歸 |由于稀釋率為a 〇8時(shí)體系已被破壞，故作圖時(shí)舍去 該點(diǎn)），求得 YGm!U = 1. 560g/g 和 m = 0. 009g。
2.6服咖,? c£iwi/)€sfris—9902 比生長速率對菌
體產(chǎn)率的影響
由Mnnod方程變形得3口皡,,/(卜-^)(4)
因「) = [1，所以 S = DKV(p^-D)(5)
g0.5 .
〇11111
00.020.040.060.089,1
K-ll/h).
囝7比生長速率叫與菌體產(chǎn)串DX的關(guān)系
穩(wěn)態(tài)時(shí)，對限制性養(yǎng)分葡萄糖進(jìn)行物料平衡可求
得
X = Y(SU-S)(6)
將式5代人式6得
X = YX/5[S〇-DK5/(JI„„-D)](7)
故
DX=DY1/5|S〇-DK5/((j..„-D)l(S!
為求得DX達(dá)到最大值時(shí)的D
d(DX)/dD=0(9)
解方程(8)和(9),并假設(shè)Y.x/S不受D的影響，則 D = D. = )L.„[I - (K./fKs + So))1'-'](10)
將（!■_=0. 18901T1，K,=4].32s/I.，S〇=40g/L 代人式(10)得最適理論稀釋速率D„ = 0. 05428h -1。
圖7為DX隨A而變化的曲線，曲線呈鐘罩形，由 計(jì)算所得最佳理論稀釋速率與曲線峰值逼近，黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究,說明理 論值與試驗(yàn)結(jié)果相符3曲線與橫坐標(biāo)D為0時(shí)的交點(diǎn) 0. 1684和計(jì)算所得最大比生長速率0. ]890較為接 近，進(jìn)一步證明了試驗(yàn)的正確性
3結(jié)論
通過對黃原膠發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究.得知分批發(fā) 酵過程中菌體對數(shù)增長期為12~20h PH隨發(fā)酵時(shí) 間先小幅度增加，后下降，對數(shù)增長期后平緩。1/|X 與1/S符合Momjd方程，得出最大比牛長速率 (x„„=0. I890h'飽和常數(shù)K.=4〖.32g/L,基質(zhì)得
率系數(shù)二〇, 〇62g/g，維持系數(shù)m = 0」543g/ g,h,最佳理論稀釋速率Dtn=0,0M28h_1。隨稀釋 速率增加，粘度、菌濃、產(chǎn)膠率下降，殘?zhí)巧仙?/div>
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