大程度上制約了魚(yú)肉蛋白的廣泛利用。為了擴(kuò)大魚(yú)蛋 白在食品工業(yè)中的應(yīng)用，提高水產(chǎn)品的附加值，有必 要對(duì)魚(yú)蛋白進(jìn)行改性以改善其功能特性。糖基化作用 (glycosylation)就是還原糖與蛋白質(zhì)分子上游離賴(lài)氨 酸的a-NH2或e-NHa共價(jià)連接（即美拉德反應(yīng)）而形 成糖蛋白的過(guò)程，結(jié)果可以明顯改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定 性、乳化性等，由此引起了國(guó)內(nèi)外研究者極大的關(guān)注。 到目前為止，糖基化改性已應(yīng)用于卵清蛋白[1，2]、片乳 球蛋白[3,4]、酪蛋白[5]、大豆蛋白[6]、魚(yú)蛋白[7?11]和蕓豆 蛋白[12]等，對(duì)改善蛋白質(zhì)的溶解性[8,9,11]、熱穩(wěn)定性

[1?3，11]、乳化性[4,5,7,9，1U2]以及鈣結(jié)合能力[1]、降低過(guò)敏 性[3]等都有一定程度的改善，但未見(jiàn)對(duì)羅非魚(yú)蛋白糖 基化改性的報(bào)道。為此，本研究從提高羅非魚(yú)肉蛋白 功能特性的角度出發(fā)，選用葡萄糖、乳糖、葡聚糖、 羧甲基纖維素鈉和殼聚糖作為糖基供體對(duì)羅非魚(yú)肉肌 原纖維蛋白進(jìn)行干熱糖基化改性的研究，探討糖的種 類(lèi)和改性程度對(duì)肌原纖維蛋白溶解性和熱穩(wěn)定性的影 響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

鮮活羅非魚(yú)，體重為（950±15) g，購(gòu)于湛江市 霞山區(qū)步行街肉菜市場(chǎng)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。去內(nèi)臟、 去皮，取其背部白肉切碎備用，凱氏定氮法檢測(cè)其蛋 白含量（17.80士0.28) %。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白的提取

參照文獻(xiàn)[7]的方法，羅非魚(yú)肉分散于3倍體積的 NaCl 溶液（50 mmol/L，含 0.5%的 TritonX-100)中漂 洗10 min，傾去懸浮物。漂洗后的魚(yú)肉于8倍體積的 上述溶液中高速均質(zhì)2 min，然后用紗布過(guò)濾。濾液 冷凍離心（8000 xg，4 °C，10 min)，沉淀分散于50 mmol/L NaCl溶液中再離心，重復(fù)5次后冷凍干燥即 得肌原纖維蛋白。上述所有操作均在8 C以下進(jìn)行， 蛋白含量采用凱氏定氮法檢測(cè)。

1.2.2肌原纖維糖蛋白的制備

肌原纖維蛋白分散于NaCl溶液（50 mmol/L)中， 使其最終濃度為6 mg/mL，糖基化改性對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白功能特性的影響,然后加入不同種類(lèi)的糖(蛋 白:糖=1:1，m/m)，充分混勻后冷凍干燥。取干粉在密 閉條件（RH=65%，T=50 C)下進(jìn)行干熱反應(yīng)，120 h 內(nèi)定時(shí)取樣。

1.2.3溶解性的測(cè)定

參照 Saeki (1997) [8]和 Sato 等（2000) [10]的方 法，干熱反應(yīng)后的混合物定量分散于Tris-HCl緩沖液 (40 mmol/L，pH 7.5，分別含 0.1 mol/L 和 0.5 mol/L 的NaCl)中，高速均質(zhì)1 min。取10 mL分散均勻的 溶液離心（10000 xg，30 min，4 C)，分別檢測(cè)離心 前分散體系中的蛋白含量和離心后上清液中的蛋白含 量。溶解性用上清液中蛋白質(zhì)的含量與離心前溶液蛋 白質(zhì)含量的比值來(lái)表示。離心前后溶液中的蛋白含量 用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，以考馬斯亮藍(lán)G-250為染色劑， 以BSA (Sigma公司）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.4 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

參照Fujiwamk等（1998) [9]的方法。干熱反應(yīng)后

的混合物定量分散于Tris-HCl緩沖液（40 mmol/L， pH 7.5，含 0.5 mol/L 的 NaCl)中，離心（10000 xg， 30 min，4 C)。取上清液80C水浴加熱1 h，冰水中 冷卻后再離心（12000 xg，30 min，4 C)，分別測(cè)定 熱處理前后上清液中蛋白質(zhì)的含量。熱穩(wěn)定性用熱處 理前后上清液中蛋白含量的比值來(lái)表示。

1.2.5 SDS-PAGE 電泳

取適量干熱反應(yīng)后的混合物進(jìn)行SDS-APGE電 泳分析[11]，實(shí)驗(yàn)所用濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度 為 7.5%。

2結(jié)果與討論

而當(dāng)反應(yīng)超過(guò)一定時(shí)間時(shí)，溶解性開(kāi)始下降。但在整 個(gè)實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，改性產(chǎn)物的溶解性均高于改性前體系 的溶解性。如在0.1 mol/L NaCl溶液中，乳糖與肌原 纖維蛋白反應(yīng)6 h后，產(chǎn)物溶解度從初始的21%提高 到74% (如圖lb)，而反應(yīng)120 h后，產(chǎn)物溶解度下 降到34.2%。很顯然，隨著干熱反應(yīng)的進(jìn)行，親水性 的糖基逐漸連接到蛋白分子上，產(chǎn)物的溶解性隨之增 大，鹽溶性的肌原纖維蛋白在低離子強(qiáng)度溶液中的溶 解性增加，且在高離子強(qiáng)度溶液中仍保持較好的溶解 性；當(dāng)反應(yīng)達(dá)到一定程度后，美拉德反應(yīng)進(jìn)入后期階 段，蛋白質(zhì)熱變性明顯，甚至出現(xiàn)焦化現(xiàn)象，反應(yīng)產(chǎn) 物的溶解性也隨之降低；（2)不同種類(lèi)的糖與肌原纖 維蛋白干熱反應(yīng)產(chǎn)物溶解性隨反應(yīng)時(shí)間變化的程度和 速率不完全相同。葡萄糖和乳糖為糖基供體時(shí)，反應(yīng) 產(chǎn)物的溶解性隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變化的速率較快， 在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，反應(yīng)6?12 h后產(chǎn)物溶解性即達(dá)到最 大，而此后隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降；而葡聚糖、 殼聚糖和羧甲基纖維素鈉為糖基供體的反應(yīng)產(chǎn)物溶解 性隨時(shí)間的變化速率相對(duì)較慢；比較而言，羧甲基纖 維素鈉為糖基供的反應(yīng)產(chǎn)物溶解性最好，這主要與糖 的分子大小和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖和 乳糖屬于小分子的還原糖，與蛋白質(zhì)反應(yīng)速度較快， 而葡聚糖、殼聚糖和羧甲基纖維素鈉的分子量較大， 還原性相對(duì)較弱，且羧甲基纖維素鈉的粘度較大，因 此受還原性及空間位阻等的影響，糖基化反應(yīng)速度較 慢。因此，干熱糖基化反應(yīng)過(guò)程中，必須選擇合適的 糖，嚴(yán)格控制反應(yīng)程度，糖基化改性對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白功能特性的影響,以使體系中蛋白質(zhì)與還原糖 基的作用盡量控制在美拉德反應(yīng)的前期階段。

2.2糖基化反應(yīng)對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性 的影響

化。由圖可知：反應(yīng)時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性的 影響比較復(fù)雜。（1)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，葡萄糖、乳糖與 肌原纖維蛋白混合改性的樣品反應(yīng)6 h后熱穩(wěn)定性已 開(kāi)始下降，此后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系的熱穩(wěn)定 性略有增加，但總體仍低于未反應(yīng)混合物的熱穩(wěn)定性， 由此進(jìn)一步表明小分子還原糖和蛋白質(zhì)的反應(yīng)非常 快，產(chǎn)物的顏色褐變非常明顯，蛋白質(zhì)熱變性嚴(yán)重， 體系的溶解性和熱穩(wěn)定性都隨之下降；（2)葡聚糖和 殼聚糖作為糖基供體時(shí)，干熱反應(yīng)產(chǎn)物熱穩(wěn)定性隨反 應(yīng)時(shí)間的變化比較緩慢，且總體呈先上升后下降的趨 勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，殼聚糖與羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白 反應(yīng)72 h后，體系的熱穩(wěn)定性從56.2%提高到75.2%。 但反應(yīng)達(dá)到一定程度后，熱穩(wěn)定性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)； (3)比較而言，羧甲級(jí)纖維素鈉作為供體的產(chǎn)物熱穩(wěn) 定性較好，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)反應(yīng)24 h后，體系熱穩(wěn)定性 達(dá)到80%，與糖的種類(lèi)對(duì)肌原纖維蛋白糖基化反應(yīng)產(chǎn) 物溶解性的影響相似。當(dāng)然，在本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有對(duì)反應(yīng) 產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，對(duì)體系測(cè)定結(jié)果有一定的影響， 各反應(yīng)產(chǎn)物初始（0h)時(shí)的熱穩(wěn)定性就不完全相同， 表明各種糖對(duì)體系的熱穩(wěn)定性有一定的影響。綜合分 析，預(yù)期選擇羧甲基纖維素鈉作為羅非魚(yú)肉肌原纖維 蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的糖基化改性研究。

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2.3糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜分析 

為了進(jìn)一步了解干熱糖基化反應(yīng)進(jìn)行的程度，對(duì) 不同種類(lèi)的糖與羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白干熱糖基化產(chǎn) 物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3。由圖 可知，以葡萄糖和乳糖作為糖基供體的干熱糖基化產(chǎn) 物SDS-PAGE圖譜基本相似。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 泳動(dòng)速率下降，反應(yīng)產(chǎn)物分子量逐漸增大。由此進(jìn)一 步表明，小分子的還原糖與肌原纖維蛋白反應(yīng)較快， 隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小分子的還原糖與蛋白分子共 價(jià)結(jié)合，產(chǎn)物分子量增大。而葡聚糖、殼聚糖和羧甲 基纖維素鈉作為糖基供體的干熱糖基化產(chǎn)物SDS- PAGE圖譜基本相似。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)產(chǎn) 物的泳動(dòng)速率變化不大，分子量變化不明顯，SDS- PAGE電泳圖譜只顯示肌原纖維蛋白譜帶。這也進(jìn)一 步表明多糖與肌原纖維蛋白的反應(yīng)速率較慢，反應(yīng)較 易控制在美拉德反應(yīng)的前期階段。其原因可能是受多 糖受分子量、空間結(jié)構(gòu)的影響，還原糖基的作用相對(duì) 于葡萄糖和乳糖較弱，反應(yīng)速度較慢；還有一種可能 就是多糖與肌原纖維蛋白以非共價(jià)鍵（氫鍵或疏水相 互作用）的形式結(jié)合，在電泳樣品處理過(guò)程中，蛋白 質(zhì)在戶(hù)巰基乙醇作用下完全變性，而電泳條帶顯示的 結(jié)果始終都是肌原纖維蛋白。

3結(jié)論

小分子的葡萄糖和乳糖與肌原纖維蛋白干熱反應(yīng) 的速度較快，糖基化改性對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白功能特性的影響,隨著反應(yīng)時(shí)間（0~120 h)的延長(zhǎng)，糖基 化改性程度增加，SDS-PAGE分析顯示產(chǎn)物的分子量 逐漸增大，反應(yīng)嚴(yán)格控制在美拉德反應(yīng)前期階段時(shí)， 可以改善產(chǎn)物的溶解性，且在低離子強(qiáng)度溶液中改善 更為明顯；大分子的殼聚糖、葡聚糖和羧甲基纖維素 鈉與肌原纖維蛋白反應(yīng)的速度較慢，SDS-PAGE分析 顯示產(chǎn)物分子量變化不明顯，而反應(yīng)控制在20 h左右 時(shí)，產(chǎn)物的溶解性和熱穩(wěn)定性都能得到有效的改善； 比較而言，羧甲基纖維素鈉對(duì)肌原纖維蛋白溶解性和 熱穩(wěn)定性的改善效果最好。因此，選擇羧甲基纖維素 鈉作為糖基供體，控制合適的干熱反應(yīng)程度，可以有 效改善羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白的溶解性和熱穩(wěn)定性。