第一章緒論

1.1生物醫(yī)用高分子材料

生物醫(yī)用材料是用來(lái)對(duì)生物體進(jìn)行診斷、治療、修復(fù)或替換其病損組織、器 官，或增進(jìn)其功能的材料。生物醫(yī)用材料按照材料的組成和性質(zhì)可以分為生物醫(yī) 用金屬材料、生物醫(yī)用無(wú)機(jī)非金屬材料（生物陶瓷)、生物醫(yī)用高分子材料、生 物醫(yī)用復(fù)合材料和生物衍生材料（生物再生材料）[1]。

生物醫(yī)用高分子材料，顧名思義，是和醫(yī)學(xué)、生物學(xué)發(fā)展有關(guān)的高分子材料 的總稱 ,生物醫(yī)用高分子材料是生物醫(yī)用材料中發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛、用量 最大的材料，是一個(gè)正在迅速發(fā)展的領(lǐng)域[1]。

1.1.1生物醫(yī)用高分子材料特性

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)材料的性能提出了越來(lái)越高的要求，這是大多數(shù)金屬材 料和無(wú)機(jī)材料難以滿足的，而合成高分子材料與生物體（天然高分子材料）有著 極其相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且其來(lái)源豐富，能夠長(zhǎng)期保存、品種繁多、性能可變化、 范圍廣，如從堅(jiān)硬的骨頭和牙齒、強(qiáng)韌的指甲，到柔軟而有彈性的肌肉組織、透 明的角膜等都可以用高分子材料制作，而且其可加工成各種形狀復(fù)雜的形狀，因 此生物醫(yī)用高分子材料在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。目前，利用生物醫(yī)用高 分子材料制作的各種醫(yī)療裝置，如植入型全人工心臟、腎、肝、胰、膀胱、皮、 骨、角膜、接觸鏡、晶體、心臟瓣膜、內(nèi)外耳修復(fù)、各種尺寸的血管以及縫線等 都獲得了臨床應(yīng)用[2]。

1.1.2生物醫(yī)用高分子材料分類

目前生物醫(yī)用高分子材料根據(jù)材料來(lái)源，可分為天然生物醫(yī)用高分子材料和 合成生物醫(yī)用高分子材料，根據(jù)其穩(wěn)定性可分為不可降解型生物醫(yī)用高分子材料 和生物降解型醫(yī)用高分子材料，根據(jù)其應(yīng)用，可分為固定、縫合材料，人工臟器、 藥用高分子材料、血液凈化高分子材料及診斷用高分子材料。

1.1.2.1非生物降解型醫(yī)用高分子材料

非生物降解型高分子醫(yī)用材料主要包括聚氨酯、聚丙烯酸酯、硅橡膠等，廣 泛用于肌腱、韌帶、血管、皮膚、人工臟器、牙齒和骨等人體軟、硬組織及器官 的修復(fù)和制造以及黏合劑、人工晶體、材料涂層等。其特點(diǎn)是大多數(shù)不具有生物

活性，與組織不易牢固結(jié)合，易導(dǎo)致過(guò)敏性、致毒性等反應(yīng)。

聚氨酯具有出色的物理機(jī)械性能和良好的生物相容性，對(duì)人體具有良好的生 理可接受性，并可以保持人體植入的長(zhǎng)期穩(wěn)定性[3]。聚氨酯全稱為聚氨基甲酸酯， 是主鏈上含有重復(fù)氨基甲酸酯基團(tuán)的大分子化合物的統(tǒng)稱。聚氨酯由多元醇、小 分子擴(kuò)鏈劑與異氰酸酯共聚而成，其分子鏈包括軟段和硬段，軟段由多元醇（聚 醚、聚酯等）構(gòu)成，硬段由異氰酸酯和小分子擴(kuò)鏈劑（二胺或二醇）構(gòu)成，通過(guò) 改變軟硬段的結(jié)構(gòu)、分布、相對(duì)比例及改變相對(duì)分子質(zhì)量等方式，可以大幅度地 改變聚氨酯的性能。與其他生物醫(yī)用材料相比，聚氨酯的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)特征是微 相分離結(jié)構(gòu)，由于硬段的極性強(qiáng)，相互間吸引力大，容易聚集在一起形成許多微 區(qū)，這樣硬段和軟段在熱力學(xué)上具有自發(fā)分離傾向，硬段的微區(qū)分布于軟段相中， 從而產(chǎn)生微相分離。這種微相分離表面結(jié)構(gòu)與生物膜很相似，由于存在著不同表 面自由能分布狀態(tài)，改進(jìn)了材料對(duì)血清蛋白的吸附能力，抑制了血小板在材料表 面的粘附，減少了血栓的形成，因此聚氨酯具有良好的血液相容性和生物相容性， 加上聚氨酯優(yōu)異的物理機(jī)械性能，且分子設(shè)計(jì)可控性強(qiáng)，因此聚氨酯作為生物醫(yī) 用材料很早就收到人們的重視[4]。

聚甲基丙烯酸酯俗稱“有機(jī)玻璃”，由于具有良好的生物學(xué)性能，包括良好 的生物相容性、骨結(jié)合性和生物學(xué)惰性，即植入人體后與天然骨之間不發(fā)生反應(yīng)， 以及良好的物理機(jī)械性能，包括良好的機(jī)械強(qiáng)度、良好的透明性，在濕態(tài)下柔軟、 富有彈性、透氣性好等[5]，可被用于作為骨缺損修復(fù)材料[6]和軟接觸鏡片材料[7]。

1.1.2.2生物降解型醫(yī)用高分子材料

生物降解型醫(yī)用高分子材料在體內(nèi)一段時(shí)間能夠充分發(fā)揮其功能，一段時(shí)間 后開(kāi)始降解并且失去其原有的功能，其降解的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)新陳代謝后被人體吸收或 被排出體外。由于生物降解型醫(yī)用高分子材料不需要二次實(shí)施外科手術(shù)將其取 出，因此在需要臨時(shí)性存在的植入治療中有廣闊的應(yīng)用前景。主要應(yīng)用在外科手 術(shù)隔離材料、手術(shù)縫合線、人造血管、人造皮膚、骨固定及修復(fù)和藥物控制釋放 等領(lǐng)域

生物降解型高分子根據(jù)來(lái)源可分為天然和人工合成兩類，合成生物降解型高 分子的代表為聚酸酐、脂肪族聚酯等。天然可降解型高分子來(lái)自于動(dòng)植物或人體 內(nèi)天然存在的高分子，例如纖維素、殼聚糖等天然生物多糖，蛋白質(zhì)、酶等天然 高分子等。天然高分子都具有良好的生物相容性，無(wú)毒，且降解產(chǎn)物可隨新陳代 謝被人體吸收或排除體外。

纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種生物多糖，是取之不盡用之不 竭的天然高分子，人類最寶貴的天然可再生資源。纖維素的分子式(C6H1()O5)„， 2

是由D-葡萄糖以P-1, 4糖苷鍵組成的大分子多糖，分子量50000?2500000, 相當(dāng)于300?15000個(gè)葡萄糖基，是植物細(xì)胞壁的主要成分。纖維素結(jié)構(gòu)式如圖 1-1 所示[11]。

 

纖維素結(jié)構(gòu)單元上的3個(gè)醇羥基可以發(fā)生各種酯化、磺化和醚化反應(yīng)[12]， 因而可以制造出多種纖維素衍生物，在很大程度上改變纖維素的性質(zhì)，常見(jiàn)的纖 維素衍生物包括硝酸纖維素、醋酸纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖 維素和羧甲基纖維素。纖維素衍生物材料可用于制備藥物緩釋系統(tǒng)[13]和制造各 種醫(yī)用膜[14]。

羧甲基纖維素是纖維素和一氯醋酸鈉經(jīng)醚化作用制成的，是以羧甲基鈉 (-CH2COONa)取代纖維素葡萄糖基環(huán)上羥基（-OH)的氫而生成的一種纖維 素醚，簡(jiǎn)稱CMC，羧甲基纖維素通常以鈉鹽形式存在，通常所說(shuō)的CMC是指 羧甲基纖維素鈉。CMC具有良好的成膜性，良好的生物相容性，常被用作防粘 連材料和止血材料。孫康[15]等對(duì)半流體CMC椎板切除后硬膜粘連的預(yù)防效果進(jìn) 行了研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明CMC作為三維屏蔽材料既能包繞神經(jīng)根又可保護(hù)硬膜， 能夠有效防止硬膜粘連。李有柱[16]等人利用Fe3+改性CMC,改性后的CMC能 有效防止或減輕術(shù)后的腹膜粘連，而且不會(huì)影響創(chuàng)口和創(chuàng)面的愈合。目前臨床上 使用的可溶性止血紗布的主要成分就是CMC[17],止血過(guò)程通過(guò)物理止血和生理 止血協(xié)同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)[18]，當(dāng)接觸血液時(shí)，CMC吸收血液中的水分而溶脹成膠狀 體，使血液粘度變大，流速減慢[19]，形成的粘性體能夠填補(bǔ)創(chuàng)面的空隙，從而 使毛細(xì)血管封閉，達(dá)到止血的目的[2G]。同時(shí)CMC可與血液中的Fe2+形成不溶性 覆蓋物或填充物從而使創(chuàng)面止血[21]。另外，溶解的CMC還可釋放出負(fù)離子，能 活化血液中的凝血因子，凝集血小板，起到凝血的作用，達(dá)到止血的目的?？扇?性止血紗布最終在人體內(nèi)降解為單糖被人體吸收[22]。

甲殼素是另一種重要的天然生物多糖，甲殼素的化學(xué)名稱是（1，4) -2-乙酰 胺基-2-脫氧-P-D-葡聚糖[23],甲殼素具有良好的成膜性，分子鏈上含有羥基和氨 基，可經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾對(duì)其改性。值得注意的是甲殼素具有優(yōu)良的生物性能，首先， 甲殼素及其衍生物是無(wú)毒副作用的天然高分子，因此具有良好的生物相容性；其 次，甲殼素具有優(yōu)異的生物活性，其制品具有抗菌、降低血清和膽固醇含量、抑 制成纖維腫瘤細(xì)胞以及促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫等作用；再 次，甲殼素生物降解性好，且降解產(chǎn)物無(wú)毒能被人體吸收[24]。甲殼素作為生物 醫(yī)用材料的應(yīng)用包括制備人工皮膚、可吸收縫線[25]，另外甲殼素有望在生物降 解支架材料[26]以及藥物緩釋材料P7]領(lǐng)域發(fā)揮作用。

蛋白質(zhì)也是一種重要的生物醫(yī)用高分子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。膠 原蛋白是一種動(dòng)物體內(nèi)含量豐富的蛋白質(zhì)，在動(dòng)物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色。 為生物科技產(chǎn)業(yè)最具關(guān)鍵性的原材料之一，也是需求量十分龐大的最佳生物醫(yī)用 材料。其應(yīng)用領(lǐng)域包括生物醫(yī)用材料、化妝品、食品工業(yè)、研究用途等。膠原蛋 白具有良好的生物性能，在人工皮膚[28]、骨組織[29]和軟骨組織[3()]領(lǐng)域應(yīng)用較廣 泛。

酶也被稱為“酵素”，指由生物體內(nèi)活細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物催化劑，生物體 內(nèi)的化學(xué)變化幾乎都是在酶的催化作用下進(jìn)行，酶的作用具有高度專一性，而且 效率很高，一個(gè)酶分子在一分鐘內(nèi)能催化數(shù)百至數(shù)百萬(wàn)個(gè)“底物”分子的轉(zhuǎn)化。 酶在醫(yī)療保健方面的應(yīng)用，可以分為兩部分：一是治療，二是診斷。酶可用于制 備醫(yī)藥制劑，由于酶制劑具有作用明確、專一性強(qiáng)、療效好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用作 抗炎清瘡、助消化、促纖溶、促凝、抗腫瘤、促進(jìn)生物氧化以及解毒等方面的治 療用藥[3|]。酶?jìng)鞲衅魇抢秒娀瘜W(xué)裝置檢測(cè)酶反應(yīng)中生成或消耗的物質(zhì)（電極 活化物質(zhì)），將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，通過(guò)電信號(hào)來(lái)計(jì)算與酶反應(yīng)有關(guān)的各種物質(zhì)的 濃度。酶?jìng)鞲衅鞯闹饕獞?yīng)用是診斷疾病時(shí)檢查血液和尿液，廢水成分分析和食品 成分分析等[32]。

1.1.3生物醫(yī)用高分子表面修飾技術(shù)

醫(yī)用高分子材料是生物醫(yī)用材料的一個(gè)重要組成部分，是一類用于診斷、治 療和器官再生的高分子材料，具有延長(zhǎng)病人生命、提高病人生存質(zhì)量的作用。

生物相容性是材料用于生物醫(yī)用目的時(shí)所要具備的重要性質(zhì)。植入體內(nèi)的器 件需符合組織相容性、血液相容性的要求，用于體外場(chǎng)合的許多制件也要求一定 的生物相容性。材料的生物相容性不僅受其本體性質(zhì)的影響，而且在很大程度上 取決于材料表面的物理和化學(xué)性質(zhì)，因此為提高生物材料的生物相容性，常常對(duì) 材料或制件表面進(jìn)行改性使之滿足醫(yī)學(xué)臨床的需要。

1.1.3.1醫(yī)用高分子材料常用表面修飾技術(shù)

材料表面改性是指在不改變材料及其制品本體性能的前提下，賦予其表面新 的性能或功能。通過(guò)材料表面的改性可提高材料表面的親水性、耐老化性、耐磨

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性和生物相容性等。生物醫(yī)用材料常用的改性方法有：材料表面接枝改性、等 離子表面改性、離子束表面改性技術(shù)、材料表面生物化（包括材料表面單分子自 組裝修飾及材料表面層層自組裝修飾等）。

材料表面接枝改性是表面改性的重要方法之一，包括化學(xué)接枝法和物理接枝 法。

化學(xué)接枝方法是利用材料表面的反應(yīng)基團(tuán)與被接枝的單體或大分子鏈發(fā)生 化學(xué)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)表面接枝，包括偶聯(lián)接枝、自由基引發(fā)接枝和臭氧引發(fā)接枝。偶 聯(lián)接枝是指待改性材料表面反應(yīng)基團(tuán)與接枝分子鏈上的活性基團(tuán)形成共價(jià)鍵來(lái) 實(shí)現(xiàn)表面接枝。

物理接枝方法是通過(guò)射線產(chǎn)生聚合活性中心的接枝技術(shù)，主要包括輻射接枝 和光引發(fā)接枝。輻射接枝的輻射源包括Y射線、a射線、射線及X射線等高能 輻射，其中Y射線是最常用的輻射源。

等離子體是一種全部或部分電離的氣態(tài)物質(zhì)，含有亞穩(wěn)態(tài)和激發(fā)態(tài)的原子、 分子、離子，并且電子、正離子、負(fù)離子的含量大致相等。等離子體中的電子、 離子、原子、分子等都具有一定能量，可與材料表面相互作用，是表面發(fā)生物理 化學(xué)變化而實(shí)現(xiàn)表面改性。等離子體表面改性包括三種類型:等離子體表面聚合、 等離子體表面處理與等離子體表面接枝。

離子注入技術(shù)應(yīng)用于高分子生物材料表面改性始于80年代末。利用載能離子 轟擊高分子材料表面，使表面化學(xué)鍵斷裂，生成新的功能基團(tuán)，從而使高分子材 料的表面極性、浸潤(rùn)性和表面能發(fā)生顯著變化，從而提高其生物相容性。

自組裝單分子層是對(duì)材料表面進(jìn)行微觀設(shè)計(jì)的新方法，由于能對(duì)自組裝單分 子層分子基團(tuán)的位置和種類進(jìn)行控制，因此可以在分子水平上對(duì)材料表面進(jìn)行改 性。將聚二甲基硅氧烷橡膠進(jìn)行表面氧等離子體處理，在表面形成活性含氧基團(tuán)， 然后在材料表面自組裝三氯硅烷單分子層，通過(guò)改變?nèi)裙柰镾iCl3 (CH2) nX中 基團(tuán)X的種類還可以控制材料的各種表面生物性能，如血小板與纖維蛋白粘附 量、內(nèi)皮細(xì)胞附著程度等1331。

層層自組裝最先被Decher與他的同事們?cè)?992年發(fā)明，他們制備了可用于生 物領(lǐng)域的結(jié)構(gòu)可控的薄膜。許多物體的表面，例如金屬、硅樹(shù)脂、玻璃，在水溶 液中都帶有負(fù)電荷，將這些帶負(fù)電荷的表面浸入帶正電荷的聚電解質(zhì)溶液里，然 后用純水洗掉表面吸附不牢的聚電解質(zhì)，這樣材料表面就帶上了正電荷，再將材 料浸入帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)溶液里，這樣材料表面所帶電荷性質(zhì)又變?yōu)樨?fù)的，重 復(fù)以上步驟，就能得到在表面組裝所需結(jié)構(gòu)與厚度的多層膜，這已成為生物醫(yī)用 材料表面功能設(shè)計(jì)的有效手段之-•[34?36]。而許多天然生物大分子都帶有電荷， 也為采用經(jīng)典的靜電層層自組裝技術(shù)構(gòu)建復(fù)雜的多層膜結(jié)構(gòu)提供了方便。

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Szyk等人研究了吸附或嵌入聚苯乙烯磺酸鈉/聚烯丙胺鹽酸鹽多層膜中人血 清白蛋白的擴(kuò)散行為。他們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)與表面蛋白質(zhì)濃度和最外層聚 電解質(zhì)類型有關(guān)，但是不管蛋白質(zhì)是在多層膜表面還是內(nèi)部其橫向移動(dòng)都很大， 這就是為什么層層自組裝多層膜能作為目標(biāo)生物醫(yī)用材料涂層的原因[37]。假體 移植術(shù)后最嚴(yán)峻的問(wèn)題就是由于植入材料導(dǎo)致的細(xì)菌感染，透明質(zhì)酸/殼聚糖多 層膜由于富含氫鍵并且氫鍵間存在強(qiáng)烈的親水排斥作用，不僅可用于阻止細(xì)胞粘 附，也可用作抗菌涂層PS]。

1.1.3.2生物多糖用于生物醫(yī)用材料表面修飾的研究

聚多糖是一個(gè)大家庭，它們的分子鏈由主鏈和側(cè)鏈組成，主鏈由糖單元通過(guò) 糖苷鍵連接而成。聚多糖主要有兩種類型，一種是存在與植物細(xì)胞體內(nèi)的多糖， 主要代表為纖維素；另一種是存在于動(dòng)物組織中的多糖，典型代表為糖原。聚多 糖在生物體內(nèi)起著重要的作用。首先他們是動(dòng)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分；其 次，聚多糖是細(xì)胞膜的組成部分（又被稱為多糖包被）；再次，聚多糖可以作為 細(xì)胞表面感受器；最后，由于聚多糖的高水合作用，他們具有良好的蛋白質(zhì)排斥 性能。

由于生物多糖良好的物理、化學(xué)與生物學(xué)性能，將生物多糖用于表面修飾越 來(lái)越熱門，利用生物多糖多層膜對(duì)生物材料進(jìn)行表面改性可以有效提高材料表面 的生物性能。生物多糖作為一種天然成分，優(yōu)于合成聚合物的方面是能通過(guò)體內(nèi) 的酶自然地降解，這也是生物多糖被用于生物醫(yī)用材料表面修飾的一大優(yōu)勢(shì)。已 有許多生物多糖被用來(lái)進(jìn)行生物醫(yī)用材料的表面修飾，例如氨基化透明質(zhì)酸[39]、 季銨化殼聚糖羧甲基纖維素[41]、果膠[42透明質(zhì)酸[43]、殼聚糖肝素[45] 與粘蛋白[46]。Nguyen[47]等人將肺表面活性物質(zhì)、羧甲基纖維素與聚氧乙烯-聚氧 丙烯三嵌段共聚物接枝到一種可生物降解聚合物表面，改性后材料細(xì)胞相容性得 到提高。

1.2酶

1.2.1酶的概念

地球上到處都有生命，從宏觀可見(jiàn)的參天大樹(shù)到微觀可見(jiàn)的細(xì)菌、病毒，從 天上飛的鳥(niǎo)到水中游的魚(yú)，生物體種類繁多，形形色色，但是不管生物體如何多 種多樣，凡是有生命的地方幾乎都有酶，都需要酶，所有的生物體在一定條件下 都可以合成各種各樣的酶，生物體內(nèi)的各種生化反應(yīng)幾乎都是在酶的催化作用下

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進(jìn)行，所以說(shuō)酶既是生命活動(dòng)的產(chǎn)物又是生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)之一[48]。酶 (Enzyme)，早期是指在酵母中的意思，指由生物體內(nèi)活細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物 催化劑，與其他的無(wú)機(jī)或有機(jī)催化劑相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)，如催化效率高、高度 專一性、溫和的作用條件、酶反應(yīng)容易控制、酶的來(lái)源廣泛等。其化學(xué)組成主要 是蛋白質(zhì)或核糖核酸（RNA),按其化學(xué)組成的不同，酶可分為兩大類別，化 學(xué)組成主要為蛋白質(zhì)的酶稱為蛋白類酶，化學(xué)組成為RNA的酶稱為核酸類酶(R- 酶）。

1.2.2酶在有機(jī)體內(nèi)的重要性[49]

酶與生命活動(dòng)密切相關(guān)，酶在生物體內(nèi)大致的說(shuō)具有四種功能：

(1)執(zhí)行具體的生理活動(dòng)。例如生物膜上的Na-K-ATP酶負(fù)擔(dān)離子主動(dòng)運(yùn) 轉(zhuǎn)；碳酸酐酶維持血液的正常酸堿平衡：神經(jīng)稍上的乙酰膽堿脂酶促成神經(jīng)沖動(dòng) 的傳導(dǎo)等。

(2)參與外來(lái)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、解毒等過(guò)程，起保衛(wèi)作用。如通過(guò)二酚氧化酶 的作用可以解除酚類對(duì)生物的入侵。

(3)協(xié)同激素發(fā)揮效應(yīng)。

(4)催化代謝反應(yīng)。在機(jī)體內(nèi)已經(jīng)建立的各種代謝途徑、形成的各種代謝 體系，都是酶催化進(jìn)行的，其中最基本的包括兩種代謝系統(tǒng)，即生命物質(zhì)的復(fù)制 系統(tǒng)（主要是核酸與蛋白質(zhì)的合成）和能量的形成轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（主要是ATP的合 成）。

如果代謝系統(tǒng)中某一環(huán)節(jié)上酶出現(xiàn)了異常，發(fā)生了破壞或缺失，會(huì)造成機(jī)體 病變。上述兩種基本代謝系統(tǒng)為一切生物所必須，所以不論動(dòng)物、植物還是大多 數(shù)微生物都具有與此相關(guān)的酶、酶系統(tǒng)和輔酶。如果說(shuō)酶的催化、酶系統(tǒng)的組成 和分布保證了生命活動(dòng)的正常進(jìn)行，那么生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，為適應(yīng)各種 生理機(jī)能的需要，為適應(yīng)外界條件千變?nèi)f化，還形成了從酶的合成到酶的結(jié)構(gòu)和 活性各種水平的調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，酶不僅是高度專一性的特殊生物催化劑，而且 酶是生物機(jī)體所產(chǎn)生的，在機(jī)體內(nèi)具有特殊的重要性，酶和生命活動(dòng)密切相關(guān)， 沒(méi)有酶就沒(méi)有生命。

1.2.3溶菌酶

溶菌酶（Lysozyme)是由英國(guó)科學(xué)家Heming于1922年在人的唾液和眼淚中 首次發(fā)現(xiàn)的，因?yàn)槠渚哂腥芙饧?xì)菌的作用，所以稱其為溶菌酶。溶菌酶在自然界 中是普遍存在的，家禽、鳥(niǎo)類的蛋清和哺乳動(dòng)物的眼淚、血液、尿液、唾液、鼻 涕、乳汁和組織細(xì)胞中都有溶菌酶，從木瓜、無(wú)花果和卷心菜等植物中也能分離

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出溶菌酶，其中以蛋清中的含量最高。

溶菌酶純品為白色、微黃或黃色的結(jié)晶體或不定型粉末，無(wú)異味，易溶于水， 遇堿易被破壞.不溶于乙醚，溶菌酶分子量為14KD左右，等電點(diǎn)為11.8左右，最 適溫度為35°C，最適pH為4.0-6.5。

溶菌酶是一類蛋白質(zhì)酶，一種由129個(gè)氨基酸構(gòu)成的堿性球蛋白，分子形狀 為橢圓形。它通過(guò)水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖達(dá)到溶解細(xì)菌的作用，它能夠降解 細(xì)胞壁中肽聚糖N-乙酰胞壁酸的C1與N-乙酰葡萄糖胺的C4之間形成的糖苷鍵。 溶菌酶的活性受到溫度、pH以及其它外部環(huán)境的影響。

溶菌酶具有抗病毒和細(xì)菌的能力，溶壁微球菌提取的溶菌酶被用于治療眼部 感染和腸胃病，藥用溶菌酶已被正式批準(zhǔn)生產(chǎn)，臨床效果良好且安全[5<)]，而且 溶菌酶還可以與芐青霉素結(jié)合成復(fù)鹽，加強(qiáng)芐青霉素的抗菌作用[51]。另外由于 溶菌酶良好的抗菌消炎作用和生物相容性，也常被用于生物醫(yī)用材料表面修飾， 用于制備藥物緩釋系統(tǒng)或以提高材料表面的抗菌活性和生物相容性。Mehr〇tra[52] 等人在瓊脂糖凝膠上組裝了聚乙烯醇/聚丙烯酸/溶菌酶層層自組裝多層膜，該 LbL多層膜具有pH響應(yīng)性，在適當(dāng)pH條件下能釋放出溶菌酶，而溶菌酶與大 腦神經(jīng)因子具有相似的大小與等電點(diǎn)，通過(guò)該聚乙烯醇/聚丙烯酸/溶菌酶層層自 組裝多層膜的釋放行為的研究可以模擬聚乙烯醇/聚丙烯酸/大腦神經(jīng)因子的釋放 行為，而從組裝在瓊脂糖上的聚乙烯醇/聚丙烯酸/大腦神經(jīng)因子釋放出大腦因子 到脊椎受損點(diǎn)，有助于成年人的神經(jīng)中樞系統(tǒng)的軸突在脊椎受傷后的再生。 Rudra[53]等人組裝了聚（L-谷氨酸）/溶菌酶LbL多層膜在一種固體載體上，該聚 (L-谷氨酸）/溶菌酶LbL多層膜能抑制周圍液體環(huán)境中微球菌桿菌的生長(zhǎng)，該 多層膜有望用于食品防腐領(lǐng)域或植物器件的外層。

1.2.4酶的分離純化

1.24.1酶分離純化的基本原則[54]

酶純化就是要將酶和雜質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，或選擇性地將酶從包含雜質(zhì)的溶液中分 離出來(lái)，或者選擇性地將雜質(zhì)從酶溶液中移除出去。為了能成功地進(jìn)行酶的分離 純化，應(yīng)該注意以下問(wèn)題。

1、防止酶變形失效

防止酶的變性失活是酶分離純化過(guò)程中非常重要的問(wèn)題。一般而言，凡是可 以用于預(yù)防蛋白質(zhì)變性失活的方法與措施都可以考慮用于酶的分離純化。如下：

(1)除了少數(shù)例外，所有操作都必須在低溫條件下進(jìn)行，特別是在有機(jī)溶 劑存在的條件更應(yīng)該謹(jǐn)慎。

(2)大多數(shù)酶在過(guò)酸或過(guò)堿的條件下都不穩(wěn)定，因此應(yīng)控制整個(gè)系統(tǒng)不要 過(guò)酸或過(guò)堿。

(3)酶和其他蛋白一樣，容易在溶液表面或界面處形成薄膜而變形，因此 操作時(shí)應(yīng)盡量避免在表面形成泡沫。

(4)重金屬等能導(dǎo)致酶失效，有機(jī)溶劑能使酶變性，微生物污染以及蛋白 水解酶的存在都能使酶分解破壞，所有這些都應(yīng)避免。

2、選擇有效的純化方法

理論上，凡用于蛋白質(zhì)分離純化的方法都適用于酶，但是實(shí)際上，溶菌酶與羧甲基纖維素層層自組裝的省略印跡聚合物及醫(yī)用材料表面修飾，酶的分離 純化還有更大的選擇余地。

(1)酶純化的最終目的使要將酶以外的一切雜質(zhì)盡量除去，因此，可以在 不破壞待純化的“目的酶”的范圍內(nèi)適用各種“激烈”的手段。

(3)由于酶和它作用的底物、它的抑制劑等具有高的親和性，因此可以利 用各種親和分離色譜法；而且，當(dāng)這些物質(zhì)存在時(shí)，酶的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性往往 朝著有利的方向發(fā)展，這樣又?jǐn)U大了純化方法與純化條件的選擇范圍。

3、酶活性測(cè)定貫穿純化過(guò)程始終。

1.2.4.2常見(jiàn)酶分離純化方法

現(xiàn)有純化方法都是以酶與雜蛋白在穩(wěn)定性、理化性質(zhì)上的差異以及酶的生物 特性為依據(jù)建立起來(lái)的，例如根據(jù)酶在不同溶液中的溶解度的不同來(lái)進(jìn)行分離的 等電點(diǎn)沉降法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、雙水相萃取法等，依據(jù)分子大小進(jìn)行 分離的凝膠過(guò)濾層析、透析、超濾和離心，依據(jù)酶的電荷不同的電泳法和離子交 換層析，依據(jù)分子等電點(diǎn)進(jìn)行分離的等電聚焦、依據(jù)分子帶電性質(zhì)進(jìn)行分離的離 子交換色譜，依據(jù)酶和底物、輔助因子以及抑制劑間具有專一的親和作用特點(diǎn)而 建立的各種親和分離法等。

1.2.4.3分子印跡技術(shù)用于生物大分子分離純化

分子印跡技術(shù)來(lái)源于免疫學(xué)的發(fā)展，早在20世紀(jì)40年代，著名的諾貝爾獎(jiǎng)獲 得者Pauling就提出了以抗原為模板來(lái)合成抗體的理論[55]，為分子印跡的發(fā)展奠 定了一定的理論基礎(chǔ)。

分子印跡技術(shù)是指為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與某一分子(模板分子) 完全匹配的聚合物的實(shí)驗(yàn)制備技術(shù)。它是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的：（1)首先以具有 適當(dāng)功能基的功能單體與模板分子結(jié)合形成單體-模板分子復(fù)合物;（2)選擇適當(dāng) 的交聯(lián)劑將功能單體互相交聯(lián)起來(lái)形成共聚合物，從而使功能單體上的功能基在 空間排列和空間定向上固定下來(lái)；（3)通過(guò)一定的方法把模板分子脫去。這樣就

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在高分子共聚物中留下一個(gè)與模板分子在空間結(jié)構(gòu)上完全匹配，并含有與模板分 子專一結(jié)合的功能基的三維空穴。這個(gè)三維空穴可以選擇性地重新與模板分子結(jié) 合，即對(duì)模板分子具有專一性識(shí)別作用[56]。分子印跡聚合物制備過(guò)程示意圖如 圖1-2所示。

 

圖1-2分子印跡示意圖[56]

近幾十年來(lái)生化分離技術(shù)有了飛速的發(fā)展，人們根據(jù)不同的原理開(kāi)發(fā)出了很 多新型的分離技術(shù)，如根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的凝膠過(guò)濾層析和SDS-PAGE電 泳，根據(jù)分子等電點(diǎn)進(jìn)行分離的等電聚焦電泳，根據(jù)分子帶電性質(zhì)進(jìn)行分離的離 子交換色譜，根據(jù)分子疏水性質(zhì)進(jìn)行分離的疏水色譜和反相色譜，根據(jù)生物分子 親和性進(jìn)行分離的親和分離技術(shù)等等。其中生物親和分離的特異性最好，但由于 生物親和物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和分離十分困難，人們一直希望能夠人工合成具有類似生物 分子親和識(shí)別能力的介質(zhì)，而根據(jù)分子的大小、空間結(jié)構(gòu)和電荷分布進(jìn)行分離的 分子印跡技術(shù)使得這一希望很可能得到實(shí)現(xiàn)。On [57]等人利用甲基丙烯酸、2-(甲 胺基）甲基丙烯酸乙酯與聚丙烯酰胺的復(fù)合體系來(lái)制備溶菌酶印跡聚合物，結(jié)果 表明大概有27%溶菌酶分子不能從聚丙烯酰胺凝膠里洗脫出來(lái)，在加入甲基丙烯 酸后能冼脫出更多的溶菌酶，與非印跡聚合物相比，印跡聚合物對(duì)溶菌酶的吸附 能力提高了 83%。Himyama[58]等人在二氧化硅粒子表面制備了溶菌酶的印跡聚 合物層，該印跡聚合物對(duì)溶菌酶具有良好的可重復(fù)使用穩(wěn)定性與高的吸附選擇 性。

目前雖然在生物大分子印跡技術(shù)上已經(jīng)有了許多成果，但是仍然存在一些問(wèn)

題:(1)目前有關(guān)生物大分子印跡方面機(jī)理的研究還相對(duì)膚淺；（2)由于生物大分子

體積都比較龐大,因而尋找一些新的功能單體、交聯(lián)劑和印跡方式也是生物大分

子印跡中面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)；（3)由于生物大分子印跡應(yīng)用較多的是利用非共價(jià)鍵

作用，在非共價(jià)作用時(shí)，乙腈、氯仿等有機(jī)溶劑有利于氫鍵和離子鍵的形成和加

強(qiáng)，但酶、蛋白質(zhì)等在有機(jī)溶劑中會(huì)有變性的可能，而在水中則由于水的極性較

強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致這種非共價(jià)作用變?nèi)?。這一矛盾也成為阻礙分子印跡在生物大分子上

應(yīng)用的難題之一；（4)尋找一種溫和有效洗脫蛋白質(zhì)和酶的手段也是一個(gè)有待解

決的課題。如果洗脫后的蛋白質(zhì)和酶失活無(wú)法回收利用，這就無(wú)形中增加了成本,

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對(duì)以后酶和蛋白質(zhì)印跡聚合物的大規(guī)彳旲應(yīng)用造成了 一疋的阻礙。

1.3層層自組裝技術(shù) 1.3.1層層自組裝技術(shù)概念

 

 

 

1991年，0沈11^等[59]首次利用線型的陰、陽(yáng)離子聚電解質(zhì)通過(guò)靜電自組裝 的方法成功制備了多層復(fù)合平板膜，這之后層-層自組裝技術(shù)廣為人們接受，并 在近二十年內(nèi)得到快速發(fā)展。所謂層-層自組裝（Layer-by-layer assembly, LbL)， 即利用逐層交替沉積的方法，借助各層分子間的弱相互作用(如靜電引力、氫鍵作 用、配位作用等），使層與層自發(fā)地締合形成結(jié)構(gòu)完整、性能穩(wěn)定、具有某種特 定功能的分子聚集體或超分子結(jié)構(gòu)的過(guò)程[61]。靜電層層自組裝示意圖如圖1-3所 示。圖1-3A為自組裝多層膜的形成過(guò)程，步驟1和步驟3代表對(duì)聚電解質(zhì)的吸 附過(guò)程，步驟2和步驟4代表清洗過(guò)程。這4個(gè)過(guò)程是構(gòu)筑自組裝多層膜的基本 步驟。重復(fù)以上4個(gè)步驟即可達(dá)到理想層數(shù)的多層膜。圖1-3B代表首次吸附聚 陽(yáng)離子與聚陰離子的簡(jiǎn)化圖，圖中基材表面的原始電荷是電負(fù)性的。

圖1-3層層自組裝示意圖[6()]

層層自組裝具有許多優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)成膜基質(zhì)選擇范圍廣泛，從金屬小分子材料 到生物大分子材料都可以進(jìn)行層層自組裝，操作方便，條件溫和，成膜驅(qū)動(dòng)力的 選擇較多，制備的薄膜具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，薄膜的厚度可控等等。

1.3.2層層自組裝技術(shù)用于生物醫(yī)用高分子表面修飾

層層自組裝由于其操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣泛，條件溫和，可在水溶液中進(jìn)行， 可保持生物大分子的天然構(gòu)象和生物活性，且其組裝的層數(shù)和厚度可控，因此成 為生物醫(yī)用材料表面修飾的--種有效手段。另外許多天然生物分子在水溶液中帶

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有電荷，這更為層層自組裝技術(shù)用于生物醫(yī)用材料表面修飾提供了便利。目前層 層自組裝在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用包括以下方面：生體模仿學(xué)、生物傳感器、 藥物釋放、蛋白質(zhì)與細(xì)胞粘附、細(xì)胞功能的調(diào)解以及可移植材料。Chung [62]等人 研究了聚烯丙胺鹽酸鹽/聚丙烯酸多層膜的裝載能力與釋放行為，將亞甲藍(lán)作為 指示劑。在PH2.5/2.5條件下組裝的聚丙烯酸/聚烯丙胺鹽酸鹽多層膜能夠?qū)喖?藍(lán)裝載在多層膜的里層，是因?yàn)榫郾┧嵘系聂然芪絹喖姿{(lán)，以及該多層膜 具有滲透性能。多層膜的釋放行為依賴于環(huán)境的pH，酸性環(huán)境有助于提高釋放 速率。在酸性環(huán)境下，聚丙烯酸上的羧酸根離子變成羧酸基團(tuán)，因此羧酸根離子 與亞甲藍(lán)之間的相互作用被破壞，導(dǎo)致亞甲藍(lán)釋放出來(lái)。Boura等人[63]研究發(fā)現(xiàn) 組裝了聚苯乙烯磺酸鈉/聚烯丙胺鹽酸鹽或聚（L-谷氨酸）/聚D-賴氨酸多層膜的 表面對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Huvec)的附著能力提高。與組裝了聚D-賴氨酸或聚烯 丙胺鹽酸鹽單分子層的表面相比，多層膜顯著增加了初期細(xì)胞的粘附能力。 Try〇en-T〇th[64]等人系統(tǒng)地研究了在聚乙烯亞胺-(聚苯乙烯磺酸鈉/聚烯丙胺鹽酸 鹽)2，聚乙烯亞胺-(聚苯乙烯磺酸鈉/聚乙烯亞胺)2多層膜表面成骨細(xì)胞與人牙周 韌帶細(xì)胞的生存能力、粘附與骨顯型性能。與玻璃或塑料表面相比，聚烯丙胺鹽 酸鹽、聚谷氨酸、聚（L-賴氨酸）為最外層的表面對(duì)兩種細(xì)胞都粘附的較多，而 聚苯乙烯磺酸鈉與聚乙烯亞胺表面粘附的兩種細(xì)胞都較少。研究結(jié)果表明以聚苯 乙烯磺酸鈉、聚谷氨酸為最外層的膜對(duì)牙周細(xì)胞具有良好的生物相容性，而最外 層為聚苯乙烯磺酸鈉、聚谷氨酸、聚（L-賴氨酸）的膜對(duì)成骨細(xì)胞具有良好的生 物相容性。丁1^〇7[65]等人在植入支架表面構(gòu)筑了透明質(zhì)酸/殼聚糖多層膜，支架 已經(jīng)被用于心血管外科，他們被插入堵住的動(dòng)脈，阻止了小范圍內(nèi)的動(dòng)脈壓縮。

1.3.3層層自組裝技術(shù)應(yīng)用于分子印跡聚合物的制備

將層層自組裝多層膜進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)后得到了穩(wěn)定的多層膜，該多層膜可以用 于制備分子印跡膜。該方法能在堅(jiān)固的多層膜上產(chǎn)生印跡位點(diǎn)，并且可以隨著 LbL多層膜的溶脹與收縮對(duì)模板分子進(jìn)行釋放與吸附，該印跡方法與傳統(tǒng)印跡方 法相比能較快的吸附與釋放模板分子。Shi[66]等人將層層自組裝技術(shù)與層間結(jié)構(gòu) 光化學(xué)交聯(lián)技術(shù)相結(jié)合制備了印跡聚合物膜，該印跡膜具有穩(wěn)定的印跡位點(diǎn)，在 光交聯(lián)之后，該印跡膜顯示出良好的可重復(fù)使用穩(wěn)定性，并且能快速地吸附與洗 脫模板分子，該印跡膜對(duì)模板分子具有高的吸附選擇性。〇&11(^11也丨[67]等人以茶 堿分子為模板，在二氧化硅納米粒子表面進(jìn)行了模板分子與聚丙烯酸的層層自組 裝，并且通過(guò)聚丙烯酸的光交聯(lián)使自組裝多層膜形成交聯(lián)體系，在洗脫模板分子 后得到了 LbL多層膜印跡聚合物，該印跡聚合物對(duì)模板分子具有很好的吸附選擇 性。

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值得-•提的是，層層自組裝技術(shù)由于其制備條件溫和，可在常溫水溶液中進(jìn) 行，可以有效保持生物分子具有維持生物活性的天然構(gòu)象，因此結(jié)合了層層自組 裝技術(shù)的表面印跡法將解決蛋白質(zhì)印跡技術(shù)存在的一些難題，例如蛋白質(zhì)和酶分 子在有機(jī)溶劑里容易變形失活，生物大分子由于體積較大難以洗脫等。徐敏[68] 等人將帶負(fù)電荷的牛血清白蛋白和帶正電荷的殼聚糖交替吸附在交聯(lián)殼聚糖基 材表面，再經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后，采用5%SDS-2% HAc溶液洗脫模板蛋白質(zhì)， 制備出殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)分子印跡聚合物。溶菌酶與羧甲基纖維素層層自組裝的省略印跡聚合物及醫(yī)用材料表面修飾，該印跡聚合物對(duì)模板蛋白質(zhì) 的吸附量達(dá)到了 13.67mg/g，與非印跡聚合物相比提高了 27.7倍；對(duì)不同蛋白質(zhì) 的吸附測(cè)試結(jié)果表明，該印跡聚合物對(duì)于模板蛋白質(zhì)具有較好的特異選擇性吸附 效果。

1.4本論文立題的目的和意義

研究蛋白質(zhì)和酶對(duì)了解生命規(guī)律、指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥實(shí)踐有著重大的理論 與實(shí)踐意義，而蛋白質(zhì)和酶的分離純化是蛋白質(zhì)與酶研究中必不可少的一個(gè)環(huán) 節(jié)。蛋白質(zhì)分子印跡技術(shù)能特異性吸附分離模板蛋白，但傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)印跡技術(shù) 依然存在一些問(wèn)題，例如聚合時(shí)容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子變性失活，蛋白質(zhì)分子體積 比較龐大，傳統(tǒng)的印跡方法對(duì)蛋白質(zhì)較難洗脫等，因此目前蛋白質(zhì)印跡技術(shù)發(fā)展 的關(guān)鍵是尋找相對(duì)溫和的制備方法與洗脫環(huán)境。

生物醫(yī)用高分子材料是材料科學(xué)技術(shù)中一個(gè)正在迅速發(fā)展的領(lǐng)域，不僅技術(shù) 含量和經(jīng)濟(jì)價(jià)值量高，而且與患者生命和健康密切相關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中使用的生物 材料為實(shí)現(xiàn)新的醫(yī)療手段提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)，成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)工程中的重 要部分。但是這些材料在實(shí)現(xiàn)其臨床功能的同時(shí)，也帶來(lái)了一系列不良生物反應(yīng)， 例如術(shù)后的感染、炎癥反應(yīng)、血栓、組織增生、細(xì)胞毒性等，這些不良的反應(yīng)都 來(lái)源于材料本身與生物體的不相容性。因此，材料與生物體之間的相容性一直是 從事生物材料研究的學(xué)者們所關(guān)注和研究的科學(xué)問(wèn)題。

層層自組裝技術(shù)工藝簡(jiǎn)單，厚度可控，制備條件溫和，可實(shí)現(xiàn)多種生物分子 的表面固定，并有利于生物分子維持生物活性和天然構(gòu)象，適用于具有復(fù)雜體型 結(jié)構(gòu)的材料，已成為生物材料吸附與表面固定的研究熱點(diǎn)。

本工作擬將生物大分子材料一羧甲基纖維素和溶菌酶所具有的生物相容性 以及抗菌活性等生物活性，并結(jié)合層層自組裝技術(shù)，制備溶菌酶分子印跡聚合物 以及進(jìn)行聚氨酯醫(yī)用材料表面修飾研究，為蛋白質(zhì)選擇性吸附分離研究和醫(yī)用材 料表面修飾研究提供了新的思路和方法。

13

1.5本論文的研究?jī)?nèi)容及設(shè)計(jì)思路

本論文的主要研究?jī)?nèi)容如下：

(1)以羧甲基纖維素為天然功能單體，溶菌酶為模板分子，結(jié)合層層自組裝 技術(shù)來(lái)制備溶菌酶分子印跡聚合物，該印跡聚合物制備條件溫和，制備方法較簡(jiǎn) 單。然后利用水接觸角測(cè)試、掃描電子顯微鏡等方法對(duì)層層自組裝過(guò)程以及印跡 聚合物表面的形貌進(jìn)行分析和表征，并對(duì)印跡聚合物對(duì)于模板蛋白質(zhì)的選擇性吸 附效果和可重復(fù)使用性能進(jìn)行了分析。

(2)采用層層自組裝技術(shù)，將具有良好生物相容性以及具有抗菌活性等生物 活性的生物大分子材料一溶菌酶與羧甲基纖維素接枝到聚氨酯材料表面，希望能 提高材料的抗菌活性、血液相容性等生物性能。采用水接觸角、原子力顯微鏡、 抗菌測(cè)試和溶血試驗(yàn)等對(duì)層層自組裝的過(guò)程、材料的表面形貌以及材料的表面生 物性能等進(jìn)行了測(cè)試和分析。

14 

 

V

羧甲基纖維素與溶菌酶在基 材表面的層層自組裝

 

制備羧甲基纖維素的溶 菌酶印跡聚合物羧甲基纖維素與溶菌酶對(duì) 聚氨酯基材的表面修飾

f/

水接觸角、IR、水接觸角、AFM、表

SEM、蛋白質(zhì)吸附面羧基密度測(cè)定、

測(cè)試等抗菌活性、血液相

容性測(cè)試等

圖1-4本論文設(shè)計(jì)思路

15

本論文設(shè)計(jì)思路如圖1-4:

羧甲基纖維素基材的聚氨酯基材的制備及

制備表面官能化

第二章以羧甲基纖維素為基材的層層自組裝溶菌酶

印跡聚合物的制備

2.1引言

蛋白質(zhì)是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，它存在于人體的每一種組織與每一種細(xì)胞中，它 參與了人體的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、遺傳、新陳代謝與運(yùn)動(dòng)等全部的生命活動(dòng)過(guò)程。 因此蛋白質(zhì)的吸附分離已成為一個(gè)非常重要而活躍的研究領(lǐng)域。隨著科技進(jìn)步， 使得新型分離技術(shù)的開(kāi)發(fā)，需求迫切。分子印跡技術(shù)能產(chǎn)生對(duì)模板蛋白的特異吸 附位點(diǎn)，該吸附位點(diǎn)具有對(duì)模板蛋白的形狀、大小與電荷分布的印跡能力，能特 異性吸附分離模板蛋白。近年來(lái)，分子印跡技術(shù)在對(duì)蛋白質(zhì)的印跡上取得了可喜 進(jìn)展，已經(jīng)成功印跡了多種蛋白質(zhì)，如牛血清蛋白、血紅蛋白、蛋白酶、溶菌酶 等。但是將分子印跡技術(shù)用于蛋白質(zhì)分離方面仍然存在一些問(wèn)題，例如，聚合時(shí) 易導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活，模板蛋白質(zhì)分子體積太大難以洗脫等，另外由于蛋白質(zhì)幾乎 不溶于有機(jī)溶劑，其分子印跡過(guò)程應(yīng)該主要是在水溶液中進(jìn)行的。因此，對(duì)功能 單體和印跡方式的選擇就顯得極為重要，這就要求我們尋找一種條件溫和的蛋白 質(zhì)印跡方法來(lái)解決上述問(wèn)題。

層層自組裝（Layer-by-layer assembly, LbL)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新自組 裝技術(shù)，該技術(shù)的主要特點(diǎn)是在荷電的基材表面通過(guò)靜電相互作用交替地吸附上 帶相反電荷的聚電解質(zhì)離子。該技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)，如組裝分子的選擇范圍廣泛， 其制備工藝簡(jiǎn)單，制備條件溫和，可在常溫水溶液中進(jìn)行，可以有效保持生物分 子具有維持生物活性的天然構(gòu)象，利用自組裝方法構(gòu)筑多糖和蛋白質(zhì)多層膜的研 究已有文獻(xiàn)報(bào)道[69?72]。Shi[66]等人結(jié)合層層自組裝與光交聯(lián)的方法制備的分子印 跡聚合物對(duì)模板分子具有良好的選擇性吸附能力。

羧甲基纖維素是一種重要的水溶性纖維素醚類衍生物，由于具有無(wú)毒、可降

解和可再生等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛地用于各種生物膜材料[73'76]。與聚N-異丙基丙烯酰

胺凝膠相比，由于羧甲基纖維素的引入，使凝膠聚N-異丙基丙烯酰胺與羧甲基

纖維素的交聯(lián)互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物在最佳吸附條件下對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力提高[77]。

Chen[78]等人研究了殼聚糖/竣甲基纖維素共混膜對(duì)溶菌酶的吸附行為，在pH為

9.2時(shí)共混膜對(duì)溶菌酶吸附能力最大，此時(shí)共混膜與蛋白質(zhì)之間的相互作用主要

是帶負(fù)電的羧甲基纖維素與帶正電的溶菌酶之間的相互作用。Fujim〇to[79]等人研

16

究了表面接枝了羧甲基纖維素的膜與牛血清白蛋白（BSA)的相互作用，隨著 羧甲基纖維素的取代程度增加，羧甲基纖維素與BSA相互作用增加，同時(shí)pH 也是影響膜對(duì)BSA吸附能力的一個(gè)重要因素。

由于纖維素衍生物良好的成膜性，以纖維素衍生物為支撐體來(lái)制備分子印跡 聚合物己有文獻(xiàn)報(bào)道。張茂升18()]等以0.45^111混合纖維素酯膜為支載膜，丙烯酰 胺為功能單體，N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，通過(guò)表面印跡法制備牛血清 白蛋白分子印跡膜，結(jié)果表明，相較于非印跡膜而言，該分子印跡膜表現(xiàn)出良好 的識(shí)別滲透能力。李婧嫻[81]等采用濕相轉(zhuǎn)化法制備了以活性艷藍(lán)為印跡分子的 醋酸纖維素-聚偏二氟乙烯分子印跡膜，所制得的分子印跡膜是一種特異分子吸 附膜，對(duì)印跡分子具有親和性。

基于上述研究背景，本工作以羧甲基纖維素為天然功能單體，溶菌酶為模板 分子，結(jié)合層層自組裝技術(shù)來(lái)制備溶菌酶分子印跡聚合物。該印跡聚合物制備條 件溫和，制備方法較簡(jiǎn)單，有利于減少制備過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)變性失活的影響，為目 前蛋白質(zhì)的吸附和分離提供一種新的方法。

17

2.2實(shí)驗(yàn)部分

2.2.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)主要藥品如表2-1所示：

表2-1主要試劑和藥品

藥品名稱規(guī)格廠家

羧甲基纖維素鈉（CMC)化學(xué)純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

三氯化鐵（FeCl3 • 6H20)分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

磷酸氫二鈉（Na2HP04 • 12H20) 分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

磷酸二氫鈉（NaH2P04 *21120) 分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

乙醇分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

甘油分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

溶菌酶（Lys)生化試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

(BR)

牛血清白蛋白（BSA)Sigma分裝

氯化鈉（NaCl)分析純天津市永大化學(xué)試劑有限公司

本實(shí)驗(yàn)主要儀器如表2-2所示：

表2-2主要實(shí)驗(yàn)儀器

儀器規(guī)格廠家

恒溫磁力攪拌器85-2 型鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司

電熱鼓風(fēng)干燥箱101-OA泰斯特儀器有限公司

真空干燥箱DZ-1A泰斯特儀器有限公司'

恒溫?fù)u床HQ45Z 武漢中科科儀發(fā)展有限責(zé)任公司

紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)UV-7504上海欣茂儀器有限公司

pH計(jì)PHS-3C上海雷磁儀器廠

TopPette移液器P200、P_DragonMed

超聲清洗KQ-50E昆山市超聲儀器有限公司

接觸角儀C201上海梭倫科技

傅里葉變換紅外光譜儀NexusThermo Nicolette, U.S

掃描電子顯微鏡 JSM-5610LVJEOL Ltd., Japan

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2.2.2層層自組裝溶菌酶印跡聚合物的制備

(1)制備羧甲基纖維素膜片

配制濃度為30 g/L的羧甲基纖維素(CMC)水溶液，并加入20 %無(wú)水乙醇 和1.5 %的甘油，磁力攪拌至半透明、無(wú)顆粒的膠狀體，然后將此膠體涂布于光 滑潔凈的玻璃表面皿里，置于溫度為65°C的干燥箱中干燥成膜，倒入8.5%的 FeCl3溶液浸泡20分鐘后倒出并用蒸餾水清洗膜片表面，自然風(fēng)干，剝下，得 到黃色透明的羧甲基纖維素膜，記為C-CMC。將所得C-CMC膜片用打孔器制 成直徑為7.0mm，厚度約為0.3mm的圓形膜片，然后用乙醇超聲清洗3次（每 次5min)。清洗完畢后室溫干燥備用。為與印跡聚合物比較起見(jiàn)，C-CMC記為 NIP (非印跡聚合物，Non-imprintedpolymer)。

(2)羧甲基纖維素與溶菌酶在羧甲基纖維素基材表面的層層自組裝

將羧甲基纖維素溶解于憐酸鹽緩沖溶液（0.2M，pH7.4)中，其中羧甲基纖 維素濃度為3mg/mL;將溶菌酶（Lys)溶解于磷酸鹽緩沖溶液（0.2M，pH7.4) 中，其中溶菌酶濃度為lmg/mL。將羧甲基纖維素膜片置于PH7.4磷酸鹽緩沖 溶液中浸泡0.5 h，用去離子水清洗4-6次，然后將膜片置于溶菌酶的磷酸鹽緩沖 溶液中反應(yīng)20 min，分離出膜片后用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)清洗4-6次，再將膜片 加入到羧甲基纖維素的磷酸鹽緩沖溶液中反應(yīng)20 min,分離出膜片后用磷酸鹽緩 沖溶液反復(fù)清洗4-6次，完成基材表面的第一個(gè)雙分子層自組裝。重復(fù)上述過(guò)程， 在兩種溶液中分別交替自組裝5次后，得到羧甲基纖維素為最外層的表面含5 個(gè)雙分子層的膜片。其中C-CMC代表未經(jīng)層層自組裝修飾的羧甲基纖維素膜片， C-CMC/Lys代表自組裝一個(gè)溶菌酶分子層的膜片，C-CMC/(Lys-CMC)代表自組 裝第一個(gè)雙分子層，最外層為羧甲基纖維素的膜片，C-CMC/Lys-(CMC-Lys)代表 自組裝第一個(gè)雙分子層，最外層為溶菌酶的膜片，依次類推。

(3)溶菌酶在自組裝羧甲基纖維素基材表面的印跡

將上述步驟（2)制備的膜片用去離子水反復(fù)清洗，然后浸入8.5 %的FeCl3 溶液在25°C條件下反應(yīng)20 min，然后用去離子水反復(fù)清洗4-6次，平鋪于平底 玻璃盤中自然風(fēng)干。

(4)模板蛋白質(zhì)的洗脫

將上述步驟（3)所得到的竣甲基纖維素膜片采用5M氯化鈉溶液作為洗脫 液洗脫模板蛋白質(zhì)，溶菌酶與羧甲基纖維素層層自組裝的省略印跡聚合物及醫(yī)用材料表面修飾，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫液中溶 菌酶含量，直至洗脫液中溶菌酶吸光值為0,即制備了羧甲基纖維素的層層自組 裝溶菌酶印跡聚合物，記為MIP(印跡聚合物，Molecularly imprinted polymer)。

19

2.2.3水接觸角表征

采用接觸角測(cè)試儀（C201，上海梭倫科技）表征溶菌酶與羧甲基纖維素在 羧甲基纖維素膜片表面層層自組裝過(guò)程中表面水接觸角的變化。將2pL的去離 子水滴在待測(cè)膜片表面，待穩(wěn)定后測(cè)出膜片與水滴的左右兩個(gè)夾角，每個(gè)樣品測(cè) 量6次，其平均值為最終的水接觸角，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為接觸角的誤差。

2.2.4羧甲基纖維素膜溶脹率測(cè)定

取一定質(zhì)量（m〇)的C-CMC膜片置于pH為7.4,離子強(qiáng)度為0.2的磷酸鹽 緩沖溶液中，隔一段時(shí)間將膜片取出用濾紙吸干膜片表面水分，稱量并記錄其質(zhì) 量（n^)，計(jì)算其溶脹率，計(jì)算方法如公式（2-1)。

溶脹率Wnn-moVmoXlOO%公式（2-1)

2.2.5紅外光譜測(cè)試

羧甲基纖維素鈉、氯化鐵改性的羧甲基纖維素鈉分別用紅外光譜儀（Thermo Nicolette，U.S)進(jìn)行表征，采用KBr壓片法制樣后在^(MOOOcm—1波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃

描。

2.2.6掃描電鏡（SEM)測(cè)試

印跡與非印跡的羧甲基纖維素膜片用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM- 5610LV, JEOLLtd., Japan)觀察其表面形貌的變化，對(duì)于不導(dǎo)電的羧甲基纖維素樣品，觀 察前需在表面噴鍍一層導(dǎo)電金屬，鍍膜厚度控制在5-10nm。

2.2.7蛋白質(zhì)吸附測(cè)試

(1)模板蛋白質(zhì)吸附測(cè)試

首先采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-7504,上海欣茂儀器有限公司）測(cè)試模 板蛋白質(zhì)在磷酸鹽緩沖溶液里的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)試印跡聚合物（MIP)與非印 跡聚合物（NIP)對(duì)模板蛋白質(zhì)的吸附量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法為：配制幾個(gè)已知濃度的蛋白質(zhì)溶液，測(cè)定每種濃度溶 液在280nm處的吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制趨勢(shì)線即為 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

20

取MIP及NIP膜片相同質(zhì)量各0.5 g (ma)，分別加入相同體積的模板蛋白 質(zhì)溶菌酶（lmg/mL)溶液8 mL,密封后置于搖床上室溫震蕩吸附，每隔一段時(shí) 間測(cè)定蛋白溶液的吸光值直至讀數(shù)穩(wěn)定不變達(dá)到吸附平衡為止。采用如下公式計(jì) 算蛋白質(zhì)的吸附量：

Q=(C〇-Ce)XV/ma公式（2-2)

C〇一蛋白吸附的初始濃度（mg/mL);

Ce—蛋白質(zhì)吸附過(guò)程中的平衡濃度（mg/mL);

V—蛋白溶液的體積（mL);

ma—膜片的重量（g)。

印跡聚合物對(duì)模板蛋白質(zhì)的印跡效果采用印跡因子（〇0來(lái)評(píng)價(jià)[82]。

a = QMIP/QNIP公式（2-3)

其中QMIP和QNIP分別為MIP及NIP及對(duì)于蛋白質(zhì)的吸附量。

(2)蛋白質(zhì)選擇性吸附測(cè)試

首先測(cè)試牛血清白蛋白BSA、溶菌酶Lys在磷酸鹽緩沖溶液里的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 然后采用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UV-7504,上海欣茂儀器有限公司）測(cè)試經(jīng)層 層自組裝印跡前后對(duì)非模板蛋白質(zhì)吸附量的變化。分別取〇.5gMIP及NIP膜片 置于分別含有8 mL的BSA (1 mg/mL)、Lys (1 mg/mL)的2種蛋白質(zhì)磷酸緩 沖溶液的燒杯中震蕩吸附，達(dá)到平衡后，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在280nm波 長(zhǎng)處檢測(cè)各燒杯中的蛋白質(zhì)濃度，測(cè)試MIP、NIP兩種聚合物膜片對(duì)于這兩種蛋 白質(zhì)的吸附量。

(3)模板蛋白質(zhì)再吸附測(cè)試

將吸附有模板蛋白的羧甲基纖維素的層層自組裝溶菌酶印跡聚合物采用5M 氯化鈉作為洗脫劑洗脫除去模板后，再將洗脫后的溶菌酶印跡聚合物浸入溶菌酶 溶液中進(jìn)行震蕩吸附直至達(dá)到吸附平衡，重復(fù)上述洗脫與吸附步驟，并采用紫外 -可見(jiàn)分光光度計(jì)在280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)溶液中的模板蛋白質(zhì)濃度，測(cè)試印跡聚合 物對(duì)于模板蛋白質(zhì)再次吸附量的變化。

21

2.3結(jié)果與討論

 

2.3.1羧甲基纖維素膜的制備

圖2-1氯化鐵改性前后羧甲基纖維素膜的紅外光譜圖

 

0.5

11.5

時(shí)間00

圖2-1為氯化鐵改性前后羧甲基纖維素膜的紅外光譜圖，如圖所示，CMC 代表未改性羧甲基纖維素，C-CMC代表改性后羧甲基纖維素，與CMC的譜圖 相比,OCMC在1614cm—1和1423 cnT1左右的-COO_振動(dòng)特征吸收峰發(fā)生了移動(dòng)， 這說(shuō)明CMC上的-COO_與氯化鐵發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)[83]。

2.5

圖2-2C-CMC膜片在磷酸鹽緩沖溶液（0.2M，pH7.4)中的吸水率

圖2-2為C-CMC膜片在磷酸鹽緩沖溶液中吸水率隨時(shí)間的變化情況。如圖 所示，經(jīng)過(guò)0.5小時(shí)后，膜片已經(jīng)達(dá)到溶脹平衡，吸水率為80%左右；然后超

22

過(guò)0.5小時(shí)以后，C-CMC膜片吸水率變化不明顯。此外，未經(jīng)氯化鐵溶液處理 的CMC膜片，在憐酸鹽緩沖溶液中發(fā)生溶解。上述吸水率測(cè)試結(jié)果初步說(shuō)明， 經(jīng)過(guò)氯化鐵溶液處理后，C-CMC膜片產(chǎn)生了一定程度的交聯(lián)。

SK8 7 6 5 4 3 2 1

r- —2

 

/

 

2.3.2水接觸角表征

圖2-3層層自組裝過(guò)程中羧甲基纖維素膜片表面的水接觸角

圖2-3為層層自組裝過(guò)程中羧甲基纖維素膜片表面的水接觸角變化情況，其 中C-CMC代表未經(jīng)層層自組裝修飾的羧甲基纖維素膜片，C-CMC/Lys代表自組 裝一層溶菌酶分子層的膜片，溶菌酶與羧甲基纖維素層層自組裝的省略印跡聚合物及醫(yī)用材料表面修飾，C-CMC/(Lys-CMC)代表自組裝第一層雙分子層， 最外層為羧甲基纖維素的膜片，C-CMC/Lys-(CMC-Lys)代表自組裝第一層雙分子 層，最外層為溶菌酶的膜片，依次類推。如圖所示，層層自組裝修飾過(guò)程中聚氨 醋表面的水接觸角呈鋸齒狀下降趨勢(shì)，C-CMC膜片的水接觸角為71.0°，組裝一 層溶菌酶分子使膜片的水接觸角下降為44.0°，當(dāng)層層自組裝達(dá)到五層雙分子層 時(shí)膜片表面的水接觸角逐漸達(dá)到穩(wěn)定值（接觸角為28.7 °)。以上結(jié)果表明經(jīng)過(guò) 層層自組裝修飾后C-CMC膜片表面水接觸角降低，親水性得到改善。

2.3.3印跡聚合物（MIP)與非印跡聚合物（NIP)表面形貌分析

采用掃描電鏡觀察非印跡聚合物膜片與印跡聚合物膜片的表面形貌。

23

 

圖2-4 MIP與NIP表面的掃描電鏡圖

圖2-4為印跡前后羧甲基纖維素膜片表面的掃描電鏡圖,其中圖2-4a為MIP 的表面形貌圖，圖2-4b為NIP的表面形貌圖。如圖所示，MIP表面相對(duì)于NIP 表面更粗糙，并且表面出現(xiàn)了尺寸大約O.l^m左右的微孔結(jié)構(gòu)。這些微孔結(jié)構(gòu)的 出現(xiàn)增加了羧甲基纖維素的比表面積，有利于增加模板蛋白質(zhì)的吸附量。另外， 由于MIP表面出現(xiàn)了較多的微孔結(jié)構(gòu)，這些微孔結(jié)構(gòu)有利于模板蛋白質(zhì)在印跡 聚合物表面進(jìn)行吸附和擴(kuò)散，這將有利于避免相對(duì)處于內(nèi)層的蛋白質(zhì)在后續(xù)的分 離過(guò)程中難以洗脫的問(wèn)題，并為蛋白質(zhì)的洗脫和再吸附提供了條件。

2.3.4蛋白質(zhì)吸附測(cè)試

c2axz)uon&ospv >n

 

聚合物對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力是根據(jù)溶液中蛋白質(zhì)的濃度變化來(lái)計(jì)算，而溶液 中的蛋白質(zhì)濃度是根據(jù)蛋白質(zhì)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算的。配制一定濃度的蛋白 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在280 nm處采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定每種濃度溶液的吸光 度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2-5為溶菌酶（Lys) 與牛血清白蛋白（BSA)在磷酸鹽緩沖溶液（0.2M, pH7.4)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2-5溶菌酶（Lys)與牛血清白蛋白（BSA)吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

24

ooooooooo

64208642

1111

cixod 3/ uooJd 3S)

uosdjo 的 p<

 

A UPNIP

圖2-6 MIP與NIP對(duì)模板蛋白的吸附量

圖2-6表示了 MIP及NIP對(duì)模板蛋白溶菌酶的吸附量。從圖中可以看出， MIP對(duì)溶菌酶的吸附量為144.02mg/mL，NIP對(duì)溶菌酶的吸附量為98.83 mg/mL， 相比NIP, MIP對(duì)模板蛋白的吸附能力提高了 50%左右。通過(guò)公式（2-3)計(jì)算 得到MIP的印跡因子a為1.5左右。以上結(jié)果說(shuō)明制備的羧甲基纖維素的層層自 組裝溶菌酶印跡聚合物有效提高了對(duì)模板蛋白溶菌酶的吸附量和吸附能力。

表2-3 MIP與NIP對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附量

樣品吸附能力(mg/mL)

LysBSA

MIP144.020

NIP98.833.17

表2-3為Mff和NIP對(duì)模板蛋白（Lys)和參比蛋白（BSA)吸附能力的比 較。從表中可以看出MIP對(duì)模板蛋白的吸附量為144.02mg/mL, MIP對(duì)參比蛋 白沒(méi)有吸附能力，NIP對(duì)模板蛋白和參比蛋白的吸附量分別為98.83 mg/mL和 3.17mg/mL，相比非印跡聚合物，制備的印跡聚合物對(duì)模板蛋白的吸附能力提高, 而對(duì)參比蛋白的吸附能力下降。以上結(jié)果表明，印跡聚合物對(duì)模板蛋白質(zhì)Lys 的選擇性識(shí)別能力提高。

25

(3>l!a10JdMUI) s!0*sp«dK3 uopcuosp<

 

First Second Third Fourth

圖2-7 MIP對(duì)模板蛋白的再吸附量

圖2-7為羧甲基纖維素的層層自組裝溶菌酶印跡聚合物經(jīng)過(guò)重復(fù)洗脫后對(duì)模 板蛋白質(zhì)溶菌酶的吸附量。如圖所示，MIP第二次再吸附時(shí)的吸附量與第一次相 比變化不明顯，第三次再吸附時(shí)的吸附量為第一次吸附能力的70%左右，而第四 次再吸附量為第一次的50%左右。以上結(jié)果表明，該溶菌酶印跡聚合物具有良好 的可重復(fù)利用性能。

2.4本章小結(jié)

本工作以羧甲基纖維素為天然功能單體，利用層層自組裝技術(shù)與分子印跡技 術(shù)相結(jié)合，制備溶菌酶分子印跡聚合物，主要結(jié)論如下：

1、以羧甲基纖維素為天然功能單體，以溶菌酶為模板蛋白質(zhì)分子，通過(guò)層 層自組裝技術(shù)將帶相反電荷的羧甲基纖維素和溶菌酶交替吸附到羧甲基纖維素 基材表面進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，制備了羧甲基纖維素的層層自組裝溶菌酶印跡聚合 物。

2、水接觸角測(cè)試表明，經(jīng)過(guò)羧甲基纖維素與溶菌酶層層自組裝修飾后的竣 甲基纖維素膜片表面的水接觸角明顯下降。掃描電鏡圖片顯示，印跡聚合物的表 面相對(duì)于非印跡聚合物表面變的粗糙，并且表面出現(xiàn)了微孔結(jié)構(gòu)。

3、蛋白質(zhì)吸附測(cè)試表明，與非印跡聚合物相比，羧甲基纖維素的層層自組 裝溶菌酶印跡聚合物對(duì)于模板蛋白質(zhì)溶菌酶的吸附量提高了 50%左右，并且該印 跡聚合物對(duì)于模板蛋白質(zhì)具有選擇性吸附效果，再吸附測(cè)試表明該溶菌酶印跡聚 合物具有良好的可重復(fù)利用性能。

26

第三章羧甲基纖維素與溶菌酶層層自組裝修飾聚氨

酯材料的研究

3.1 引 g

聚氨酯全稱為聚氨基甲酸酯，是主鏈上含有重復(fù)氨基甲酸酯基團(tuán)的大分子化 合物的統(tǒng)稱。它是由有機(jī)二異氰酸酯或多異氰酸酯與二羥基或多羥基化合物加聚 而成。通過(guò)改變?cè)戏N類及組成，可以大幅度地改變產(chǎn)品形態(tài)及其性能，得到從 柔軟到堅(jiān)硬的最終產(chǎn)品。

在聚氨酯彈性體中，由于軟硬段的不相容性，存在明顯的微相分離結(jié)構(gòu)，其 中軟段提供彈性，硬段起到增強(qiáng)填充和交聯(lián)作用，分子結(jié)構(gòu)中的軟硬段的極性差 異使其具有良好的生物相容性。聚氨酯由于其突出的物理機(jī)械性能和良好的生物 相容性在制造植入人體的各種器件如人工肺、人工心臟瓣膜、人工皮膚、人工血 管等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景[84]。然而，普通生物醫(yī)用材料作為內(nèi)置材料在植入 人體后會(huì)產(chǎn)生一系列不良生物反應(yīng)，如術(shù)后的炎癥反應(yīng)、血栓和細(xì)胞毒性等[85]。 這些不良反應(yīng)均來(lái)源于材料與生命環(huán)境的生物不相容性反應(yīng)。醫(yī)用高分子材料植 入人體后，最先和直接與組織、細(xì)胞相接觸和作用的是材料的表面。因此，醫(yī)用 高分子材料的表面性能是影響其生物相容性的主要因素之一，它將影響細(xì)胞吸 附、增殖、分化等一系列反應(yīng)。傳統(tǒng)的表面修飾手段包括物理共混和表面化學(xué)接 枝等，但是采用簡(jiǎn)單的物理共混方式制備的材料可控性差[86]，而表面化學(xué)接枝 一般制備步驟繁雜且較難在具有復(fù)雜形狀結(jié)構(gòu)的人造器官和裝置上實(shí)現(xiàn)[87]。溶菌酶與羧甲基纖維素層層自組裝的省略印跡聚合物及醫(yī)用材料表面修飾，因 此尋求一種易行、有效的表面修飾手段成為醫(yī)用裝置表面設(shè)計(jì)的關(guān)鍵性問(wèn)題。

層層自組裝（Layer-by-layer assembly, LbL)技術(shù)是一種在材料表面交替吸附 帶相反電荷聚電解質(zhì)的技術(shù)，該技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)，例如操作條件溫和，能在常溫 水溶液中進(jìn)行•，使用范圍廣泛，蛋白質(zhì)、酶、生物多糖等天然高分子均可以進(jìn)行 層層自組裝而且不會(huì)變性失活；可控性強(qiáng)，能在分子尺度和納米級(jí)別對(duì)材料表面 進(jìn)行改性；另外，該方法適用的基體材料范圍廣泛，能在形狀復(fù)雜的器件上實(shí)施。 因此利用層層自組裝技術(shù)對(duì)生物醫(yī)用材料進(jìn)行表面改性是一種理想的方法。 Tan[8S]等人在材料表面進(jìn)行了聚乙烯亞胺與肝素的層層自組裝，經(jīng)自組裝后的材 料能夠抵抗血小板的粘附，并能延長(zhǎng)靜態(tài)凝固時(shí)間，抗凝血功能提高，該方法為

27

心臟血管裝置的表面改性提供了一種新方法。丁丨化^^^等人利用層層自組裝技 術(shù)對(duì)金屬支架表面進(jìn)行改性，他們將透明質(zhì)酸/殼聚糖LbL多層膜組裝到金屬支架 表面，提高了材料的抗凝血性能。Cai™等人將殼聚糖/明膠LbL多層膜組裝到鈦 材料表面，骨細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)LbL改性后的鈦材料表面細(xì)胞相容性提高。Zhu [91]等利用靜電自組裝的方法將帶異種電荷的聚乙烯亞胺和明膠交替沉積在聚 (D-賴氨酸-丙交酯）（PDL-LA)基質(zhì)表面制備了一種類細(xì)胞外基質(zhì)，并以軟骨 細(xì)胞為模板研究了這種改性PDL-LA基質(zhì)表面的細(xì)胞行為（細(xì)胞的黏附、增殖和 活性）和形態(tài)，結(jié)果顯示經(jīng)多層膜表面修飾后PDL-LA基質(zhì)能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的 黏附和生長(zhǎng)。

溶菌酶（Lysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶（Muramidase)或N-乙醜胞壁質(zhì)聚糖水 解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase)，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性

酶。主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的0 -1,4糖 苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而 使細(xì)菌溶解。該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。將溶菌酶接枝到生物醫(yī)用材 料表面可以提高材料的抗菌活性和生物相容性。MUSZamka[92]等人將溶菌酶接枝 到聚氧化乙烯分子鏈表面，接枝后的材料具有優(yōu)良的抗菌性。王強(qiáng)[93]等人通過(guò) 層層自組裝技術(shù)將溶菌酶/聚苯乙烯磺酸鈉LbL多層膜組裝到羊毛纖維表面，由 于溶菌酶具有抗菌能力，與未改性羊毛相比改性后的羊毛表面抗菌率最高可達(dá) 91.7%。Conte[94]等人通過(guò)等離子表面改性技術(shù)將溶菌酶固定到聚乙烯薄膜上，結(jié) 果表明接枝了溶菌酶后的膜具有抗菌性。

本工作采用層層自組裝技術(shù)，將具有良好生物相容性以及具有抗菌活性等生 物活性的生物大分子材料一溶菌酶與羧甲基纖維素接枝到聚氨酯材料表面，希望 能提高材料的抗菌活性、血液相容性等生物性能。采用水接觸角、原子力顯微鏡、 抗菌測(cè)試和溶血試驗(yàn)等對(duì)層層自組裝的過(guò)程、材料的表面形貌以及材料的表面生 物性能等進(jìn)行了測(cè)試和分析。

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3.2實(shí)驗(yàn)部分

3.2.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備 本實(shí)驗(yàn)所用藥品如表3-1:表3-1主要實(shí)驗(yàn)藥品

藥品名稱規(guī)格廠家

羧甲基纖維素鈉（CMC)化學(xué)純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

磷酸氫二鈉分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

(Na2HP04 * 12H20)

磷酸二氫鈉分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

(NaH2P04 * 2H20)

溶菌酶（Lys)生化試劑（BR)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

甲苯分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

乙腈分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

三乙胺（TEA)分析純天津博迪化工有限公司

N,N-二甲基甲酰胺（DMF)分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

4,4’ -二苯基甲烷二異氰酸酯純度98%Aldrich

(MDI)

乙二胺分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

牛肉膏生化試劑（BR)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

蛋白胨生化試劑（BR)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

瓊脂粉生化試劑（BR)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

氯化鈉分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

Rhodamine 6G純度95%Sigma分裝

丙烯酸分析純天津市福晨化學(xué)試劑有限公司

鹽酸分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

牛血清白蛋白（BSA)Sigma分裝

大腸桿菌中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心

金黃色葡萄球菌中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心

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本實(shí)驗(yàn)主要儀器如表3-2所示：

表3-2主要實(shí)驗(yàn)儀器

儀器規(guī)格廠家

恒溫磁力攪拌器85-2 型鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司

電子天平DT302常熟意歐儀器儀表有限公司

電熱鼓風(fēng)干燥箱101-OA泰斯特儀器有限公司

真空干燥箱DZ-1A泰斯特儀器有限公司

恒溫?fù)u床HQ45Z武漢中科科儀發(fā)展有限責(zé)任公司

紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)UV-7504上海欣茂儀器有限公司

pH ifPHS-3C上海雷磁儀器廠

TopPette移液器P200、PioooDragonMed

超聲清冼KQ-50E昆山市超聲儀器有限公司

接觸角儀C201上海梭倫科技

掃描探針顯微鏡DI Nanoscope IVVeeco Metrology Group (U.S)

立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-Ls-75上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器設(shè)

11備廠

單人凈化工作臺(tái)SW-CJ-2D蘇州凈化設(shè)備有限公司

恒溫培養(yǎng)箱DPX-9272B-1上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司

自動(dòng)三重水蒸餾器SZ-97上海亞榮生化儀器廠

3.2.2聚氨酯薄膜的制備

將商用聚氨酯（PU)顆粒18?21g裝入索氏提取器中先后用甲苯、甲醇各 索氏提取48h。再將純化后的聚氨酯乳膠粒溶于提純后的N，N’-二甲基甲酰胺 (DMF)中，待攪拌完全溶解后將溶液倒入平底成膜盤內(nèi)（D=12cm)，在65°C 條件下干燥48h,待溶劑完全揮發(fā)后經(jīng)真空干燥得聚氨酯薄膜狀基材，將所得聚 氨酯薄膜狀基材用打孔器制成直徑為7.0mm，厚度約為0.3mm的圓形膜片，然 后分別用甲苯、乙醇各超聲清洗3次（每次5min)。清洗完畢后真空干燥備用。

30

3.2.3用4, 4’-二苯基甲烷二異氰酸酯對(duì)聚氨酯基材表面進(jìn)行官能化

將3.2.3中的聚氨酯膜片加入到60mL質(zhì)量百分比為7.5%的4, 4，-二苯基甲 烷二異氰酸酯（MDI)的甲苯（經(jīng)蒸餾提純）溶液中，攪拌并升溫至50°C，通 入氮?dú)獗Ｗo(hù)，然后將三乙胺按照質(zhì)量百分比為MTEA/MTcluene=2.5%的比例加入反 應(yīng)體系，混合均勻后反應(yīng)lOOmin。反應(yīng)結(jié)束后用甲苯和乙腈反復(fù)清洗膜片4?6 次，除去表面物理吸附的MDI,即為表面異氰酸酯化的聚氨酯膜片。其中TEA 是三乙胺，Toluene是甲苯。

3.2.4聚氨酯基材表面接枝氨基及基材表面帶正電

將3.2.3中表面異氰酸化的聚氨酯膜片加入到60mL質(zhì)量百分比為2%的乙二 胺的甲苯（經(jīng)蒸餾提純）溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)100 min,得到表面帶有氨基 官能團(tuán)的聚氨酯膜片，再用蒸餾水反復(fù)清洗膜片4?6次，并用去離子水清洗過(guò) 夜。干燥后將膜片在室溫下用0.012M鹽酸浸泡30 min,再用去離子水反復(fù)清洗 膜片4?6次，經(jīng)真空干燥后得表面帶正電荷的氨基化聚氨酯膜片。

3.2.5羧甲基纖維素和溶菌酶在氨基化聚氨酯表面的層層自組裝

將羧甲基纖維素溶于200mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2M, pH7.4)中，其中羧甲 基纖維素的濃度為3mg/mL;將溶菌酶溶解于200mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2M， pH7.4)中，其中溶菌酶的濃度為lmg/mL。將表面氨基官能化后的帶正電荷的 聚氨酯膜片加入到羧甲基纖維素溶液中反應(yīng)15?20min，分離出膜片后用相應(yīng)的 緩沖溶液反復(fù)清洗4?6次，制備出表面具有羧甲基纖維素的PU/CMC膜片。再 將PU/CMC膜片加入溶菌酶溶液中反應(yīng)15?20min，分離出膜片后用相應(yīng)的緩沖 溶液反復(fù)清冼4?6次，完成基材表面的第一層雙分子層自組裝；重復(fù)上述過(guò)程， 在兩種溶液中分別交替自組裝5次后，得到溶菌酶為最外層的含五層雙分子層的 表面自組裝多層膜，最后將膜片在30°C條件下真空干燥48h，即制備得到層層自 組裝修飾的具有生物相容性的聚氨酯材料。其中PU代表未經(jīng)層層自組裝修飾的 聚氨酯膜片，PU-NH2代表表面氨基官能化的膜片，PU/(CMC-Lys)代表組裝了一 層雙分子層且溶菌酶為最外層的膜片，PU/CMC-(Lys-CMC)代表組裝了一層雙分 子層且羧甲基纖維素為最外層的膜片，依次類推，PU/(CMC-Lys)5代表組裝了五 層雙分子層且溶菌酶為最外層的膜片。

3.2.6水接觸角測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)采用接觸角測(cè)試儀（C201，上海梭倫科技）表征聚氨酯膜片層層自

31

組裝修飾過(guò)程中親水性的變化。將2pL的去離子水滴在待測(cè)聚氨酯膜片表面， 待穩(wěn)定后測(cè)出膜片與水滴的左右兩個(gè)夾角，每個(gè)樣品測(cè)量6次，其平均值為最終 的水接觸角，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為接觸角的誤差。

3.2.7原子力顯微鏡（AFM)

用掃描探針顯微鏡（DINan〇SC〇peIV,U.S)采用輕敲模式觀察聚氨酯膜片與 經(jīng)層層自組裝修飾的聚氨酯膜片表面形貌的變化。

3.2.8表面羧基密度測(cè)定

在聚氨酯表面進(jìn)行羧甲基纖維素與溶菌酶進(jìn)行層層自組裝過(guò)程中，取出最外 層為羧甲基纖維素的膜片測(cè)定其表面羧基密度。將膜片用去離子水清洗干凈后， 65°C的條件下真空干燥24 h。采用83^95]等介紹的方法來(lái)測(cè)定膜片表面羧基密 度。將4mg Rhodamine6G溶于4mL憐酸鹽緩沖溶液（pH12)中，然后加入分 液漏斗并加入lOOmL甲苯萃取，取上層液體即為制備出的 Rhodamine-Benzene(RB)染色劑溶液。將DMF與染色劑以4:1的比例混合，然后 加入定量的丙烯酸生成羧酸/羅丹明復(fù)合物。在535nm處用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) (UV-7504,上海欣茂儀器有限公司）測(cè)量這種羧酸/羅丹明復(fù)合物的吸光系數(shù)并 做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將膜片溶解到DMF-RB染色劑溶液中，并測(cè)量其在535nm處的 吸光系數(shù)。為了扣除空白聚氨酯的影響，空白聚氨酯也溶解到DMF-RB染色劑 溶液中，并測(cè)量其在535nm處的吸光系數(shù)。膜片表面的羧基密度可利用上述標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。

3.2.9抗菌活性測(cè)試

抗菌活性測(cè)試過(guò)程按照中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：《抗菌塑料一抗菌性 能測(cè)試方法和抗菌效果》[96]執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用連續(xù)轉(zhuǎn)接2次的新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物 (24h內(nèi)轉(zhuǎn)接的），加入培養(yǎng)液中，依次做10倍遞增稀釋，選擇合適濃度的稀釋 液作為試驗(yàn)用菌液（選擇菌液濃度的標(biāo)準(zhǔn)為固體培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的菌落數(shù)量在 30-300這個(gè)范圍內(nèi)）。按照GB 4789.2《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》 [97]的方法操作。在每個(gè)培養(yǎng)管中加入2mL菌液，分別加入5片層層自組裝修飾 前后的聚氨酯膜片，而不加入膜片的培養(yǎng)管作為空白對(duì)照組，在37°C恒溫振蕩 培養(yǎng)24小時(shí)后，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算出菌落數(shù)目。每組數(shù)據(jù)做兩次平行實(shí)驗(yàn)，每 個(gè)樣品做三個(gè)平行抗菌測(cè)試。

32

抗細(xì)菌率計(jì)算公式為：

R(%) = (B-C) /BX100%公式（3-1)

R—抗細(xì)菌率（％)

B—空白對(duì)照樣品平均回收菌數(shù)（CFU/片）

C一抗菌塑料樣品平均回收菌數(shù)（CFU/片）

3.2.10溶血實(shí)驗(yàn)

層層自組裝修飾前后聚氨酯膜片的血液相容性用溶血試驗(yàn)來(lái)表征。測(cè)試過(guò)程 參考中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 16175-2008《醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評(píng)價(jià) 試驗(yàn)方法》[98]進(jìn)行。將待測(cè)膜片放入含有10mL生理鹽水的試管中，以10mL蒸 餾水的試管為陽(yáng)性對(duì)照，10mL生理鹽水的試管為陰性對(duì)照，將試管分別放入37 °C水浴中30min。將新鮮抗凝血液用生理鹽水按4:5稀釋，然后向每個(gè)試管中加 入0.2mL稀釋的血液，在37°C恒溫水浴中維持60 min。然后以2500r/min離心10 min。小心抽取上清液，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-7504在545nm處測(cè)定其吸光度。 每組數(shù)據(jù)做兩次平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品做三個(gè)平行測(cè)試。

溶血率計(jì)算公式為：

溶血率=[(AM-A_)/(A_-A 瞧)]x 100%公式(3-2)

其中A樣品代表測(cè)試樣品的吸光度，A酣代表陰性對(duì)照的吸光度，A陽(yáng)性代表 陽(yáng)性對(duì)照的吸光度。

3.3結(jié)果與討論

3.3.1層層自組裝修飾前后聚氨酯膜片水接觸角表征

圖3-1為聚氨酯膜片層層自組裝過(guò)程中的水接觸角變化，其中PU代表未經(jīng) 表面修飾的聚氨酯膜片，PU-NH2代表表面氨基官能化的膜片，PU/(CMC-Lys) 代表組裝了一層雙分子層且溶菌酶為最外層的膜片，PU/CMC-(Lys-CMC)代表組 裝了一層雙分子層且羧甲基纖維素為最外層的膜片，依次類推，PU/(CMC-Lys)5 代表組裝了五層雙分子層且溶菌酶為最外層的膜片。如圖所示，未進(jìn)行表面修飾 的聚氨酯材料的水接觸角為73.0°,氨基化改性后聚氨酯材料水接觸角下降為 69.0°，經(jīng)過(guò)層層自組裝修飾后的聚氨酯的水接觸角在組裝完第一層雙分子層后， 呈緩慢下降的趨勢(shì)，當(dāng)層層自組裝達(dá)到五層雙分子層時(shí)其水接觸角為42.3°。以

33

上會(huì)〇果表明，經(jīng)過(guò)層層自組裝表面修飾后的聚氣酷材料表面的苯水性提同。溶菌酶與羧甲基纖維素層層自組裝的省略印跡聚合物及醫(yī)用材料表面修飾，而材 料表面親水性的改善有利于提高材料生物相容性，陳寶林等將磺酸根通過(guò)聚氧乙 稀鏈為“間隔臂”復(fù)合在聚氨酯上時(shí)，不僅可通過(guò)有效地阻抗血小板的粘附，而 且可以有效阻抗內(nèi)源和外源凝血途徑；聚氧乙烯鏈的高親水性和柔順性、磺酸根 的負(fù)電性和降低材料表面電位的作用以及似肝素活性等多種抗凝血有利因素的 復(fù)合為改善材料的血液相容性提供了有效途徑[1(W]。 

5 0 5 0 5 0 5 0 5 77665 5 443

€

 

 

 

圖3-1層層自組裝過(guò)程中聚氨酯膜片表面的水接觸角

3.3.2表面羧基密度測(cè)定

在聚氨酯膜片表面進(jìn)行羧甲基纖維素與溶菌酶層層自組裝過(guò)程中，取出最外 層為羧甲基纖維素的膜片測(cè)定其表面羧基密度[95]。

表3-3層層自組裝過(guò)程中聚氨酯膜片表面羧基密度

樣品表面竣基密度（(xmoL/cm2)

PU0

PU/CMC0.915

PU/CMC-(Lys-CMC)1.353

PU/CMC-(Lys-CMC)21.490

PU/CMC-(Lys-CMC)31.983

PU/CMC-(Lys-CMC)42.449

表3-3顯示了層層自組裝過(guò)程中聚氨酯膜片表面羧基密度的變化，其中PU

34

代表未經(jīng)層層自組裝修飾的聚氨酯膜片，PU/CMC代表組裝了一個(gè)溶菌酶單分子 層的膜片，PU/CMC-(Lys-CMC)代表組裝了一個(gè)雙分子層且羧甲基纖維素為最外 層的膜片，依次類推。如表所示，未改性的聚氨酯膜片表面無(wú)羧基存在；組裝了 一層CMC單分子層后，膜片表面羧基密度增大為0.915pm〇L/Cm2,接著組裝一 個(gè)雙分子層后，膜片表面羧基密度為增加大1.353nm〇L/cm2,接著組裝了四個(gè)雙 分子層后，膜片表面羧基密度達(dá)到2.449pin〇L/Cm2。以上結(jié)果表明，隨著聚氨酯 膜片表面組裝的羧甲基纖維素層數(shù)的增加，膜片表面羧基密度是逐漸增大的。

3.3.3層層自組裝修飾前后聚氨酯膜片的原子力顯微鏡表征

圖3-2為層層自組裝修飾前后聚氨酯膜片的原子力顯微鏡圖片，其中PU代 表未經(jīng)層層自組裝修飾的聚氨酯材料，PU/(CMC-Lys)5代表溶菌酶為最外層組裝 五個(gè)雙分子層的聚氨酯材料。如圖所示，與聚氨酯膜片相比，經(jīng)層層自組裝修飾 后的聚氨酯膜片其表面的凹凸結(jié)構(gòu)有所增加。研究表明相比化學(xué)組成，材料的表 面形貌對(duì)材料的生物活性影響更大，材料表面納米或微米級(jí)別的凹凸結(jié)構(gòu)會(huì)加速 細(xì)胞在材料表面的粘附[1()1]。只£111111丨1^等人觀察到微米或納米尺度的表面形貌能 夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附[1()2~1()4]。

 

PUPU/(CMC-Lys)5

圖3-2層層自組裝修飾前后聚氨酯AFM圖

3.3.4層層自組裝修飾前后聚氨酯膜片抗菌活性測(cè)試

研究表明，生物材料表面具有抑制細(xì)菌黏附和生長(zhǎng)的生物活性，就能對(duì)植入 材料引起的術(shù)后感染及炎癥反應(yīng)起到有效控制和治療作用。本工作對(duì)羧甲基纖維 素和溶菌酶表面層層自組裝修飾的聚氨酯膜片進(jìn)行了抗菌活性測(cè)試，選用大腸桿 菌和金黃色葡萄球菌作為測(cè)試用菌，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

35

50

0

450

400

o o o o o o

5 0 5 0 5 0 3 3 2 2 1 1

rls/ply>01 x)

 

空白PUPU/(CMC-Lys)5

(as/njpolx)

 

空白PUPU/(CMC：-Lys)5

圖3-4金黃色葡萄球菌與層層自組裝修飾前后的聚氨酯共培養(yǎng)24h后的濃度

圖3-3大腸桿菌與層層自組裝修飾前后的聚氨酯共培養(yǎng)24h后的濃度

圖3-3為層層自組裝修飾前后聚氨酯膜片對(duì)大腸桿菌抗菌活性的比較，其中 空白代表未加入樣品的空白培養(yǎng)基,PU代表未經(jīng)層層自組裝修飾的聚氨酯材料， PU/(CMC-Lys)5代表溶菌酶為最外層組裝五個(gè)雙分子層的聚氨酯材料。從圖中可 以看出，經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)后，空白組的大腸桿菌的濃度為4.02X108 CFU/mL; PU組的大腸桿菌的濃度為3.80X 108 CFU/mL; PU/(CMC-Lys)5組的大腸桿菌濃 度為2.07X108CFU/mL。與未修飾聚氨酯相比，其抑菌率為45.5%。

圖3-4為層層自組裝修飾前后聚氨酯膜片對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌活性的比 較，其中空白代表未加入樣品的空白培養(yǎng)基，PU代表未經(jīng)層層自組裝修飾的聚 氨酯材料，PU/(CMC-Lys)5代表溶菌酶為最外層組裝五個(gè)雙分子層的聚氨酯材 料。如圖所示，經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)后，空白組的金黃色葡萄球菌的濃度為3.7X 1〇8 CFU/mL; PU組的金黃色葡萄球菌的濃度為3.56Xl〇8CFU，mL; PU/(CMC-Lys)5 組的金黃色葡萄球菌濃度為2.09X108 CFU/mL，與未修飾聚氨酯相比，其抑菌

36

率為41.4%。

以上結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)羧甲基纖維素和溶菌酶表面層層自組裝修飾后的聚氨酯 材料表面具有抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。溶菌酶是一種蛋白質(zhì) 酶，通過(guò)溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁而起到殺滅細(xì)菌的作用。溶菌酶對(duì)革蘭式陽(yáng)性菌 具有良好的溶菌作用，常見(jiàn)的如金黃色葡萄球菌[1<)6]、枯草桿菌[92]等，對(duì)大腸桿 菌[1()7]、普通變球菌[1G8]等革蘭氏陰性菌也有溶解作用。利用層層自組裝方法在聚 氨酯表面構(gòu)筑多層的羧甲基纖維素和溶菌酶的表面修飾層有利于提高被修飾材 料對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。

3.3.5層層自組裝修飾前后聚氨酯膜片溶血率測(cè)試

表3-4層層自組裝修飾前后聚氨酯材料表面的溶血試驗(yàn)結(jié)果

樣品吸光值溶血率（％)

陰性對(duì)照0.0413 ±0.00060

陽(yáng)性對(duì)照0.8365±0.0106100

PU0.0523 ±0.00461.38

PU/(CMC-Lys)50.0443 土 0.00060.38

生物醫(yī)用材料的溶血試驗(yàn)是測(cè)定紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白游離的程度，溶菌酶與羧甲基纖維素層層自組裝的省略印跡聚合物及醫(yī)用材料表面修飾，是對(duì)生 物醫(yī)用材料和制品的體外溶血性進(jìn)行評(píng)價(jià)的體外實(shí)驗(yàn)，溶血試驗(yàn)?zāi)軌蚍从吵鰳悠?與血液接觸時(shí)對(duì)紅細(xì)胞的破壞程度。表3-4為層層自組裝修飾前后聚氨酯材料表 面的溶血試驗(yàn)結(jié)果，其中PU代表未經(jīng)層層自組裝修飾的聚氨酯材料， PU/(CMC-Lys)5代表溶菌酶為最外層組裝五個(gè)雙分子層的聚氨酯材料。如表中所 示，未經(jīng)修飾的聚氨酯材料的溶血率為1.38%，而經(jīng)過(guò)羧甲基纖維素與溶菌酶層 層自組裝修飾的聚氨酯材料的溶血率為0.38%，這說(shuō)明經(jīng)層層自組裝修飾后聚氨 酯材料對(duì)血液中的紅細(xì)胞的破壞程度更小，與未改性聚氨酯材料相比溶血率降 低，材料的血液相容性得到一定程度的提高。相關(guān)研究也表明，利用竣甲基纖維 素對(duì)材料進(jìn)行改性能提高材料的血液相容性[1(^11(>]。

3.4本章小結(jié)

通過(guò)表面層層自組裝技術(shù)將生物多糖羧甲基纖維素與溶菌酶固定在氨基化 后的聚氨酯基材表面，其主要結(jié)果如下：

1、通過(guò)MDI與聚氨酯的反應(yīng)將異氰酸酯基團(tuán)引入聚氨酯基材表面，再與乙 二胺反應(yīng)后得到表面帶有氨基的聚氨酯基材。

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2、通過(guò)表面層層自組裝技術(shù)將羧甲基纖維素和溶菌酶固定在表面氨基化的 聚氨酯基材表面。通過(guò)原子力顯微鏡對(duì)層層自組裝修飾后的聚氨酯材料的表面形 貌進(jìn)行了分析和表征，發(fā)現(xiàn)經(jīng)層層自組裝修飾后聚氨酯材料表面的凹凸結(jié)構(gòu)有所 增加；水接觸角測(cè)試表明經(jīng)層層自組裝修飾后膜片的親水性得到改善；表面羧基 密度測(cè)試表明隨著自組裝層數(shù)增加，表面羧基密度逐漸增大。

3、通過(guò)抗菌性能的分析測(cè)試可知，層層自組裝修飾后的聚氨酯材料具有較 好的抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的作用，與未經(jīng)層層自組裝修飾的聚氨酯基 材相比，對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌率分別為45.5%和41.4%。通過(guò)溶血率測(cè)試可知，經(jīng) 過(guò)表面層層自組裝改性后，溶血率由1.38%減少為0.38%，表明被修飾的聚氨酯 材料具有更好的血液相容性。

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第四章結(jié)論

本工作采用層層自組裝方法，利用羧甲基纖維素與溶菌酶進(jìn)行了溶菌酶印跡 聚合物和聚氨酯醫(yī)用材料表面修飾的研究，主要結(jié)論如下：

1、以羧甲基纖維素為天然功能單體，以溶菌酶為模板蛋白質(zhì)分子，通過(guò)層 層自組裝技術(shù)將帶相反電荷的羧甲基纖維素和溶菌酶交替吸附到狻甲基纖維素 基材表面進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，溶菌酶與羧甲基纖維素層層自組裝的省略印跡聚合物及醫(yī)用材料表面修飾，制備了羧甲基纖維素的層層自組裝溶菌酶印跡聚合 物。水接觸角測(cè)試表明，經(jīng)過(guò)羧甲基纖維素與溶菌酶層層自組裝修飾后的羧甲基 纖維素膜片表面的水接觸角明顯下降：掃描電鏡圖片顯示，印跡聚合物的表面相 對(duì)于非印跡聚合物表面變的粗糙，并且表面出現(xiàn)了微孔結(jié)構(gòu)。維素的層層自組裝 溶菌酶印跡聚合物對(duì)于模板蛋白質(zhì)溶菌酶的吸附量提高了 50%左右，并且該印跡 聚合物對(duì)于模板蛋白質(zhì)具有選擇性吸附效果，再吸附測(cè)試表明該溶菌酶印跡聚合 物具有良好的可重復(fù)利用性能。

2、通過(guò)MDI與聚氨酯的反應(yīng)將異氰酸酯基團(tuán)引入聚氨酯基材表面，再與乙 二胺反應(yīng)后得到表面帶有氨基的聚氨酯基材；通過(guò)表面層層自組裝技術(shù)將羧甲基 纖維素和溶菌酶固定在表面氨基化的聚氨酯基材表面。通過(guò)原子力顯微鏡對(duì)層層 自組裝修飾后的聚氨酯材料的表面形貌進(jìn)行了分析和表征，發(fā)現(xiàn)經(jīng)層層自組裝修 飾后聚氨酯材料表面的凹凸結(jié)構(gòu)有所增加；水接觸角測(cè)試表明經(jīng)層層自組裝修飾 后膜片的親水性得到改善；表面羧基密度測(cè)試表明隨著自組裝層數(shù)增加，表面羧 基密度逐漸增大。通過(guò)抗菌性能的分析測(cè)試可知，層層自組裝修飾后的聚氨酯材 料具有較好的抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的作用，與未經(jīng)層層自組裝修飾的 聚氨酯基材相比，對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌率分別為45.5%和41.4%;通過(guò)溶血率測(cè)試 可知，經(jīng)過(guò)表面層層自組裝改性后，溶血率由1.38%減少為0.38%，表明被修飾 的聚氨酯材料具有更好的血液相容性。