氮源濃度對黃原膠流加發(fā)酵過程的影響：

氮源濃度對黃原膠流加發(fā)酵過程的影響，黃原膠作為最重要的微生物多糖在食品、采油等工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用.黃原膠生產(chǎn)過程 的經(jīng)濟性取決于黃原膠發(fā)酵的最終濃度，該濃度與生物反應(yīng)器中諸多環(huán)境因素密切相關(guān)，其 中氮源的種類及濃度對發(fā)酵過程均有重要影響，主要是影響細胞生長并通過細胞量的變化影 響黃原膠合成.氮源可分為有機氮源和無機氮源.早期研究表明有機氮源要優(yōu)于無機氮源， 常用 DDS (Distiller’s Dried Solubles)、CSL (Corn Steep Lique)、蛋白腺等.對濃度影響的 研究也主要是針對有機氮源[|].但有機氮源組成復(fù)雜，常含某些未知因子影響細胞生長. 此外，有機氮源還不利于黃原膠的分離回收.因此以組成確定的無機氣源考察氮源濃度對發(fā) 酵過程的影響更好.

對氮源濃度變化影響的考察主要有兩種方法：一種是基于限制營養(yǎng)技術(shù)，即固定其他培 養(yǎng)基組分，以氮源為限制底物考察其濃度變化對發(fā)酵的影響[1'21;另一種則是考慮到多種組 分間的相互作用而采用統(tǒng)計的方法對多個組分同時進行優(yōu)化[3,4].后一種方法實驗量很大， 常在搖瓶中進行，而對高粘度非牛頓物系搖瓶難以達到良好的混合，對實驗條件無法嚴格控 制.因而以第一種方法在反應(yīng)器中考察氮源濃度變化對發(fā)酵過程的影響更好.然而前人在此 方面工作還有很多不足：一是往往只簡單地通過對最終結(jié)果的比較得到結(jié)論而缺少對過程的 深入分析；二是只對間歇發(fā)酵進行研究，而對生產(chǎn)中更具優(yōu)越性的流加發(fā)酵中最佳氮源濃度 的確定卻無人進行討論.

1實驗方法

菌種為XawAowomw mNRRL- B- 1459.從活化斜面上接種后在搖床上28X: 下培養(yǎng)24h.再接種到發(fā)酵罐中，接種量8%.發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖為40gM.一 MgS04.7H20為 0.25g   L 'K2HPO4 為 0.5g.L、檸檬酸為 2g.L-1, CaC〇3 為 0.038十~、 以（NH»)2S04為氮源，其濃度為（l~5)g*L'

發(fā)酵罐為-自動控制通氣攪拌罐，總體積7 L，工作體積4 L.空氣由空氣壓縮機經(jīng)粗 細兩級膜過濾器進入罐內(nèi)，經(jīng)一環(huán)形管氣體分布器鼓出.出氣大部分放空，小部分進人呼吸

儀測量氧及二氧化碳含量.溫度控制在28 C, pH值6.8~7.0.轉(zhuǎn)速、溶氧可手動調(diào)節(jié)測量. 攪拌槳為兩個六葉透平槳，直徑120_，槳徑比為0.67.采用該槳可使在較大的黃原膠濃 度范圍內(nèi)反應(yīng)器中保持較好的混合狀況.采用逐次流加的方法控制糖濃度，流加葡萄糖溶液 濃度為225 g’L — 1,每次加人200 ml,使發(fā)酵液中糖濃度維持在（10?20) g^L1. —般每批發(fā)酵 只需進行2?3次流加，黃原膠濃度就不再增加.

發(fā)酵過程中每隔4 h左右取出10 ml樣品，適當(dāng)稀釋后在10 000#下離心20 min,細胞 沉淀加水懸浮后測定其吸光度由標準曲線確定其濃度.取lml上清液用DNS法測糖，其余 加入二倍體積酒精沉淀過濾烘干稱重以確定黃原膠濃度.

2結(jié)果與討論

不同初始氮源濃度下的細胞生長及黃原膠合成曲線如圖丨所示.由圖1可看出，氣源濃 度增加時，生長期延長，最大細胞濃度由3g*Ld增加到9g*Ld.而黃原膠濃度則在氮源 為41 (純氮0.85 g'L1)時最大，55 h時即已超過40 g‘L—1.此時糖已流加兩次，發(fā)酵液

中殘?zhí)羌s5 ^L1,總耗糖約50 g^L1,得率達0.8,優(yōu)于間歇發(fā)酵的結(jié)果，氮源濃度對黃原膠流加發(fā)酵過程的影響，與前人流加發(fā)酵結(jié) 果相比，發(fā)酵時間也大大縮短[5’6].此后雖然糖繼續(xù)消耗，膠濃度卻不再增加.在更高的氮 源濃度時黃原膠濃度反而降低，而糖消耗卻仍很多，因而得率大大降低.作者的結(jié)果與前人 所得最佳氮源濃度比較見表1.

前人在反應(yīng)器中對氮源濃度影響的研究得到了不同的結(jié)論，作者通過比較發(fā)現(xiàn)這主要與 他們所用的氮源種類及研究的濃度范圍有關(guān)，下面分別予以討論.

(a) Growth(b)Production

Fig. 1 Growth and xanthan production at different initial N - source concentrations Initial N - source concentration1 :■ 1.5; LI 3.0; <>4.0; ^4.5;〇5.0

Table 1 The best N - source concentration in previous studies

N ~ .source1rw/g*L1 Bioreactort>/g*L 1-S-r/g*L 1vwReference

CSL401.45 L fermentor21(69h)550.38[II

叫叫1. 1440.4shake flask10200.5[3J

(NH4)2S〇43.30.7shake flask16300.53[4]

nys8.00,320 L fermentor17(72 h)22.50.76[7]

glutamic acid2.250.4shake flask33(96 h)400.82[8]

續(xù)表

N - scmrcecN/g*L_lcm'/g-L 1BioreactorcP/g.L_lST/g-L 'yp/sReference

peptone5.00.8fermentor17(42 h)22.50.75[9]

ammonium salt1.0-1.25~shake flask28(72 h)400.7[10]

NH4C!0.3420.1155 L fermentor17.5(65 h)350.5[11]

(NH4)2S〇44.00.857 L fermentor40(55 h)500.8this article

CM: N-source concentration; CNT： total nitrogen concentration; rp： xanthan gum concentration; ： total C~ source tx^nsumed; Vp/s: yield.

(l)氮源濃度增加則細胞濃度增加，產(chǎn)物合成速率加快，黃原膠得率提髙[2,8].氮源 濃度較低時一般得此結(jié)論，唯獨Kennedy[l]以CSL為氮源在髙濃度下仍得此結(jié)論.這可能 是因CSL中很大一部分是碳源而與糖同時被利用，由此亦可表明應(yīng)采用無機氮源進行研究.

(2)中等濃度時氮源濃度升高則細胞濃度和合成速率均提高，發(fā)酵時間縮短，但膠得率 卻降低[1，12],對此，M0mine[l2]解釋為細胞增多使得用于細胞生長及維持的糖增多，因而用 于合成黃原膠的糖減少使得率降低.此時最終膠濃度受初糖濃度限制，而作者采用流加發(fā)酵 則可避免此限制，氮源濃度對黃原膠流加發(fā)酵過程的影響，而且后期流加的糖大多用于產(chǎn)膠，即可達到更髙的得率.

(3)氮源濃度再升高時，雖然細胞濃度繼續(xù)增加，膠合成速率及得率卻均降低.作者的 實驗結(jié)果即是如此.尚無人對高氮源濃度時出現(xiàn)這種結(jié)果的原因進行深人分析.

10 20 30 40 50 60 70020 4060

//ht/h

(a)OUR(b) Production rate

Fig. 2 OUR and xanthan production rate at different N ~ source concentrations Initial N - source concent ration/g* L 1；n3.0;〇4.0;A4.5; 〇5.0

不同氮源濃度下的氧消耗速率(OUR)與黃原膠合成速率(7?p)曲線如圖2所示.產(chǎn)物合成 速率均呈峰形，在達到一最大值后隨發(fā)酵過程的進行而降低，且濃度為5 g^L1時速率要低 于濃度較低時的結(jié)果.通過對原始實驗數(shù)據(jù)的分析，作者認為氧限制和死區(qū)是導(dǎo)致低合成速 率的主要原因.黃原膠發(fā)酵后期粘度很大，難以保證混合良好，造成氧供應(yīng)不足.黃原膠發(fā) 酵的臨界溶氧濃度約為20%[12]，而當(dāng)?shù)礉舛却笥?g*LM時，發(fā)酵經(jīng)過（30~40)h后溶 氧即降到20%以下，甚至于為零，表明發(fā)生了氧限制.此外由于非牛頓流體的剪切稀化特 性，壁附近某些區(qū)域剪切應(yīng)力很低，可能小于流體屈服應(yīng)力而使流體根本不動而成為死區(qū). 作者通過冷模流動顯示（Flow Visualization)實驗證實，在黃原膠濃度大于20 時壁處局 部區(qū)域出現(xiàn)死區(qū).多篇文獻報道在黃原膠發(fā)酵反應(yīng)器中有氧限制和死區(qū)出現(xiàn)[13，14].死區(qū)溶 氧值(DO)總為0,無法供氧，因而死區(qū)和氧限制均可歸結(jié)為氧供應(yīng)能力的不足.此時OUR 由設(shè)備供氧能力決定，因而在不同氮源濃度下OUR曲線相差不大.而氧首先應(yīng)保證細胞維 持生命的需要，在髙氮源濃度下細胞濃度較髙，導(dǎo)致維持耗氧增多，使得用于合成的氧減 少，因而合成速率降低.同時有氧限制發(fā)生時即使有足夠的糖也不能使它們充分用于產(chǎn)膠， 因而用于產(chǎn)膠的糖減少，而耗于維持的糖基本不變，導(dǎo)致得率降低.

氧限制的避免須從兩方面考慮：-是通過改進設(shè)備及操作條件消除死區(qū)提高供氧能力； 二是限制細胞濃度控制氧需求，但為T維持較高合成速率細胞濃度又不能過低，氮源濃度對黃原膠流加發(fā)酵過程的影響，這樣最佳細 胞濃度便由設(shè)備的供氧能力決定.而細胞濃度常由氮源控制，此時最佳氮源濃度便由設(shè)備決 定.這一點以前關(guān)于氮源濃度影響研究的文獻均未提及.

3結(jié)論

(1)細胞濃度隨氮源濃度增加而增加，而黃原膠合成卻在一定細胞濃度下達到最優(yōu).

(2)設(shè)備供氧能力限制是高細胞濃度下膠合成速率及得率降低的主要原因.

(3)氮源濃度對黃原膠合成速率（影響發(fā)酵時間及功耗）、最終膠濃度（影響下游分離費 用）、得率(影響原料成本)均有重要影響，必須結(jié)合具體設(shè)備進行優(yōu)化.

(4)通過設(shè)備改進供氧，氮源濃度的優(yōu)化以及流加控制糖濃度，使黃原膠濃度在55 h 內(nèi)超過40g+ l,優(yōu)于前人結(jié)果.本研究結(jié)果對黃原膠工業(yè)生產(chǎn)生物反應(yīng)器的設(shè)計及操作 條件優(yōu)化具有重要指導(dǎo)意義.

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