杜氏鹽澡（Dunaliella salina)是_種高含卜- 胡蘿卜素的廣鹽性微藻，已經(jīng)在我國(guó)及美、澳、日、以 色列等國(guó)實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模培養(yǎng),形成了較大規(guī)模的微 藻產(chǎn)業(yè)E-a。為監(jiān)測(cè)鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，在科研和 生產(chǎn)中常常以細(xì)胞數(shù)目作為生長(zhǎng)指標(biāo)^4。因此計(jì) 數(shù)鹽藻細(xì)胞數(shù)對(duì)了解細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、生物量測(cè)定 等都十分重要6-7]。目前常用的鹽藻細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 采用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法，該方法較簡(jiǎn)便、快捷， 但結(jié)果不夠準(zhǔn)確。因?yàn)辂}藻呈單細(xì)胞，橢圓形，細(xì) 胞前端長(zhǎng)出兩條等長(zhǎng)的鞭毛，約是體長(zhǎng)的1. 2 倍6-9?；钚喳}藻細(xì)胞計(jì)數(shù)法的研究在水中能自由游動(dòng)的特性造成了計(jì)數(shù)誤 差。在傳統(tǒng)的方法加鹽酸計(jì)數(shù)時(shí)，由于細(xì)胞處于死 亡狀態(tài)，所以藻細(xì)胞數(shù)目基本不變。缺點(diǎn)是死活細(xì)

胞無(wú)法區(qū)分，使計(jì)數(shù)結(jié)果偏高。

文章對(duì)血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行改進(jìn)，在菌 液中加入具有粘性的羧甲基纖維素鈉，消弱了藻細(xì) 胞在液體中的游動(dòng)性，同時(shí)又是存活狀態(tài)。改進(jìn)后 的血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法能準(zhǔn)確、可行的用于鹽藻 活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1材料和方法 1.1藻種的培養(yǎng)

藻種由內(nèi)蒙古吉蘭泰生物工程公司提供，培養(yǎng) 方法見(jiàn)文獻(xiàn)3]。

1.2藥品

羧甲基纖維素鈉（CMC) {(C8H„NaO7) n,粘度: 300 mPa • s ~800 mPa • s},分析純，北京東環(huán)聯(lián)合 化工廠生產(chǎn)。

1.3羧甲基纖維素鈉溶液濃度對(duì)藻細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性 影響

當(dāng)鹽藻細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到一定濃度的時(shí)候，取10mL 藻液，加入10 mL體積的不同濃度（6 g/L, 9 g/L, 12 g/L,15 g/L,18 g/L,21 g/L,23 g/L,26 g/L )的 羧甲基纖維素鈉溶液，搖勻?；钚喳}藻細(xì)胞計(jì)數(shù)法的研究用無(wú)菌滴管吸取少量， 從蓋薄片邊緣滴一小滴。在顯微鏡下靜置5 min后 觀察，以不加羧甲基纖維素鈉溶液為對(duì)照組。

1.4羧甲基纖維素鈉對(duì)藻細(xì)胞活性的影響

取加過(guò)羧甲基纖維素鈉的剩余鹽藻培養(yǎng)液繼續(xù) 培養(yǎng)，定時(shí)取樣在顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀況。

1.5藻細(xì)胞顯微鏡計(jì)數(shù)方法

對(duì)三種鹽藻樣品的藻液進(jìn)行計(jì)數(shù)。1號(hào)樣品為 8%鹽度,2號(hào)樣品為13%鹽度,3號(hào)樣品為18%鹽 度。取10 mL藻液，加入10 mL的23 g/L的羧甲基 纖維素鈉溶液，搖勻。用無(wú)菌滴管吸取少量,從蓋薄 片邊緣滴一小滴。在顯微鏡下靜置，靜置不同時(shí)間 2 min、min、min、min、10 min 和 12 min 后計(jì)數(shù), 每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)三次，取平均值。以加鹽酸計(jì)數(shù) (3 mol/L)和不加羧甲基纖維素鈉溶液為對(duì)照組。

2結(jié)果

2.1藻細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性

顯微鏡下鹽藻細(xì)胞的形態(tài)見(jiàn)圖1。在藻液中加 入不同濃度的羧甲基纖維素鈉溶液，藻細(xì)胞在顯微 鏡下靜置6 min后，細(xì)胞在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室內(nèi)的

運(yùn)動(dòng)狀態(tài)觀察結(jié)果見(jiàn)表1和圖2。

圖1加CMC培養(yǎng)后的鹽藻細(xì)胞 表1藻細(xì)胞在計(jì)數(shù)室內(nèi)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)觀察結(jié)果

CMC/

(g.L-1) 69121518 21 23 26

狀態(tài)移動(dòng)快移動(dòng)

較快移動(dòng)

較快移動(dòng)慢個(gè)別極個(gè)別

移動(dòng)移動(dòng)不移動(dòng)不移動(dòng)

由表1中可以看出，加入低于12 mg/mL羧甲 基纖維素鈉時(shí),鹽藻細(xì)胞在計(jì)數(shù)室內(nèi)的移動(dòng)速度比 較快，無(wú)法計(jì)數(shù)。當(dāng)加入濃度達(dá)到23 mg/mL時(shí)，鹽 藻細(xì)胞基本處于靜止?fàn)顟B(tài)，個(gè)別鹽藻在原地打轉(zhuǎn)，限

制了其在小方格之間的躍遷。在增大羧甲基纖維素 鈉的濃度時(shí)，鹽藻細(xì)胞靜止不動(dòng)，但是藻液粘性大, 給配制和定量溶液帶來(lái)困難，影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

 

圖2未加CMC計(jì)數(shù)板中方格中藻細(xì)胞的分布

由圖2、圖3、圖4和圖5中可以看出，不加羧甲 基纖維素鈉時(shí),鹽藻細(xì)胞在計(jì)數(shù)室內(nèi)的游動(dòng)速度比 較快,數(shù)量逐漸減少，逆光向著計(jì)數(shù)板的邊緣集中。 當(dāng)加入濃度達(dá)到23 g/L時(shí)，鹽藻細(xì)胞基本處于靜止 狀態(tài)，藻細(xì)胞在計(jì)數(shù)室中方格內(nèi)與計(jì)數(shù)板的逆光側(cè) 邊緣的分布基本相近。說(shuō)明在鹽藻細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)加入 羧甲基纖維素鈉是可行的，最佳加入羧甲基纖維素 鈉的濃度約為23 g/L。由圖6可得加鹽酸之后，活性鹽藻細(xì)胞計(jì)數(shù)法的研究藻 細(xì)胞已處于死亡狀態(tài)，計(jì)數(shù)時(shí)不移動(dòng)。

 

圖3未加CMC計(jì)數(shù)板逆光側(cè)邊緣藻細(xì)胞的分布

 

圖4加CMC計(jì)數(shù)室中方格內(nèi)藻細(xì)胞的分布

 

圖5加CMC計(jì)數(shù)板逆光側(cè)邊緣藻細(xì)胞的分布

 

26

鹽業(yè)與化工 

 

圖6加鹽酸計(jì)數(shù)室中方格內(nèi)的藻細(xì)胞

2.2藻細(xì)胞顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果

三種不同鹽度的藻液的鹽藻細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表

2、圖7?圖9。

表2鹽藻細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果（個(gè)/中方格)

時(shí)間/

min1號(hào)樣品2號(hào)樣品3號(hào)樣品

對(duì)照對(duì)照 1 2加

CMC對(duì)照

1對(duì)照

2加

CMC對(duì)照對(duì)照 1 2加

CMC

0702320421716431312

2642220481716381312

4672221301716261312

6432221371716241311

8222221261716201311

10152220221716181311

12后022202171551311

注：對(duì)照1為未加CMC,對(duì)照2為加鹽酸

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，鹽藻在不加入羧甲基 纖維素鈉進(jìn)行計(jì)數(shù)的時(shí)候，個(gè)數(shù)變化呈現(xiàn)不規(guī)律變 化，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，中方格中鹽藻的數(shù)目在逐漸減 少，直到最后在中方格的鹽藻細(xì)胞數(shù)目為零，藻細(xì)胞 迅速聚集到逆光的_邊;并且在計(jì)數(shù)的過(guò)程中，鹽藻 移動(dòng)的速度還是比較快,這使得無(wú)法對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。 見(jiàn)圖7 ~圖9中的對(duì)照1變化趨勢(shì)。

 

 

 

在加鹽酸計(jì)數(shù)時(shí)，由于細(xì)胞處于死亡狀態(tài)，所以 藻細(xì)胞數(shù)目基本不變。缺點(diǎn)是死活細(xì)胞無(wú)法區(qū)分， 使計(jì)數(shù)結(jié)果偏高。見(jiàn)圖7 ~圖9中對(duì)照2的變化趨 勢(shì)。

由圖7 ~圖9中加CMC的變化趨勢(shì)可知，在加 入羧甲基纖維素鈉以后，可以充分看到鹽藻在原地 打轉(zhuǎn),保持相對(duì)靜止的狀態(tài)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)， 可以看到其在25個(gè)中方格里的鹽藻數(shù)目沒(méi)有太大 的變化，在12 min以后，中方格的鹽藻數(shù)目仍然沒(méi) 有變化;并看到在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的兩邊也沒(méi)有藻細(xì) 胞的累積，經(jīng)過(guò)多次的實(shí)驗(yàn)，活的鹽藻細(xì)胞的數(shù)目始 終沒(méi)有太大的變化。并且在不同鹽度培養(yǎng)下的鹽 藻，顏色有明顯的區(qū)別，低鹽度下培養(yǎng)的偏綠，而隨 著鹽度的增加逐漸顯偏現(xiàn)淺紅色，并且隨著鹽度的 增加，鹽藻的的移動(dòng)速度比較小，但是經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的時(shí) 間，對(duì)未加羧甲基纖維素鈉的培養(yǎng)液來(lái)計(jì)數(shù),鹽藻也 會(huì)移向_邊。而在加入其之后，鹽藻細(xì)胞的數(shù)目隨 著時(shí)間沒(méi)有太大的變化。

2.3藻細(xì)胞活性檢測(cè)

取加入羧甲基纖維素鈉的鹽藻細(xì)胞加入培養(yǎng)液 后進(jìn)行培養(yǎng)，活性鹽藻細(xì)胞計(jì)數(shù)法的研究加有羧甲基纖維素鈉的鹽藻培養(yǎng)液中 的鹽藻細(xì)胞依然存活，在顯微鏡下觀察其運(yùn)動(dòng)性恢 復(fù)正常，與正常培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，形態(tài)完整沒(méi)有明 顯變化。這就充分說(shuō)明加入的羧甲基纖維素鈉對(duì)鹽 藻的生長(zhǎng)沒(méi)有太大的影響。

3結(jié)論

改進(jìn)后鹽藻血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法的最佳加入羧甲 基纖維素鈉的最佳加入濃度是23 g/L,通過(guò)對(duì)不同 鹽度下培養(yǎng)出的鹽藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，說(shuō)明了羧甲基纖維 素鈉溶液能有效的限制鹽藻細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。該計(jì)數(shù)方 法的特點(diǎn)是既保持了其原有的快速和簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)， 又具有區(qū)分死活細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)?？梢杂眠@種方案來(lái)解 決血細(xì)胞計(jì)數(shù)法難以計(jì)數(shù)活的鹽藻細(xì)胞的難題。并 

廣泛應(yīng)用于藻細(xì)胞計(jì)數(shù)的工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐和科研領(lǐng) 域。