黃原膠是經(jīng)發(fā)酵X程生產(chǎn)的一種用途廣泛的 微生物胞外多糖。在食品、石油、醫(yī)藥、日用化工 等十幾個(gè)領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用降解菌。黃原膠超 常的穩(wěn)定性極大地?cái)U(kuò)展了其應(yīng)用范圍，但在應(yīng)用 過程中其黏度過高也帶來一些問題，如在提高采 油率的同時(shí)也增加后繼工藝如原料運(yùn)輸及產(chǎn)品的 成本[2]。同時(shí)黃原膠的降解產(chǎn)物寡糖還具有抗病 毒、抑菌、誘導(dǎo)植物抗性、提高免疫力等功能，可進(jìn) —步開發(fā)利用。因此，找到能高效降解黃原膠的 微生物菌株有著生產(chǎn)應(yīng)用的潛在價(jià)值[3]。
1材料與方法
1.1菌種來源
從土壤和水中分離篩選出1株具較強(qiáng)降解能 力的黃原膠降解菌，該菌能夠以黃原膠為唯一碳 源進(jìn)行生長(zhǎng)，并具有黃原膠降解酶活性。
1.2藥品
工業(yè)級(jí)黃原膠、甘露糖、魔芋粉、葡萄糖、檸檬 酸、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、二甲基 氨基苯甲酸、溴百里酚藍(lán)、溴甲酚紫、瓊脂粉、結(jié) 晶紫、草酸銨、Na2 HP04、K2 HPC^、KH2 P04、 NH4 Cl、MnS()4、ZnS04、MgSO“ CuS04、FeS()4、 CaCl2、NaCl、Na2S04、NaOH，其它化學(xué)試劑均為 分析純 1.3培養(yǎng)基
1.3.1選擇性培養(yǎng)基（g^L1) 黃原膠5g， NH4C1 6 g,Na2HPO,5 g,NaH2P04 5 g„
1.3.2種子液培養(yǎng)基（g.L1〉 葡萄糖5g， NH4C1 6 g，Na2HP()45 g,NaH2P04 5 g，微量元 素液4 mL。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g-L1)黃原膠5g，NH4Cl 6 g，K2HF04 5 g，KH2P04 5 g,微量元素液 4 mL。
1.3.4微量元素液（mg*L-1) ZnS04 0. 1 mg, CuS04 0.1 mg,MnS04 0.1 mg»MgSO40.1 m^510 1.4儀器與設(shè)備
752紫外可見光分光光度計(jì)（南京第四分析 儀器有限公司）;CF 16RX高速冷凍離心機(jī)（日本 HITACHI公司）；ZNN-D6A型六速旋轉(zhuǎn)黏度 儀(青島海通達(dá)專用儀器廠h 1.5方法
1.5.1菌種篩選將所取土樣懸浮于滅菌后的 生理鹽水中，進(jìn)行梯度稀釋，常規(guī)方法涂布黃原膠 平板，3CTC培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑單個(gè)菌落于選擇 性培養(yǎng)基中劃線，經(jīng)過培養(yǎng)，再?gòu)闹刑暨x單個(gè)菌落 接種于新的選擇性培養(yǎng)基中，反復(fù)操作至菌種完 全純化，然后接種于斜面培養(yǎng)基中4SC保存w。 1.5.2粗酶液制備將菌種接種到含100 mL 種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，3(TC 160 r«min_1 振蕩培養(yǎng)，5 000 r*min_l 離心 10 min 收集菌體。用無菌生理鹽水洗滌菌體3次，調(diào)整 細(xì)胞濃度1〇8個(gè)•mL'制成種子液。
在500 mL三角瓶中裝200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基， 按接種量1%接人種子液，3(TC 160 i-min1振蕩 培養(yǎng)24 h 5 000 r*min_l離心10 min，上清液即粗 酶液。
1.5.3醉活測(cè)定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法 為:分別在水解管中加入〇. 5 g*I^的Glucose標(biāo) 準(zhǔn)溶液〇、5、10、30和40 pL，用雙蒸水補(bǔ)至 200 PL,向其中各加150 jiL PAHBAH溶液， 600 NaOH(5%)溶液，混勻，12(TC 加熱 15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD<1)5w。
甘露聚糖酶活力測(cè)定方法:將一定量粗酶液 與0. 25%黃原膠水溶液混合，30°C水浴反應(yīng)
45 min,立即取200 ML反應(yīng)液加到750 fxL 5% PAHBAH和5%Na()H的混合液中，12(TC加熱 15 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定OQ。.,。
黃原膠降解酶的活力定義為每分鐘催化形成 相當(dāng)于1 pmol葡萄糖的還原末端所需的酶量為 一個(gè)酶活力單位[9]。
1.5.4不同氮源對(duì)菌種產(chǎn)酶的影響用不同氮 源(含氮量終濃度為〇. 2%)代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的 NH4C1，研究各氮源如蛋白胨、胰蛋白胨、甘氨酸、 尿素、硝酸銨、磷酸氫二銨和氯化銨對(duì)產(chǎn)酶的影 響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種接種于上述培養(yǎng) 基中[1°]。
1.5.5不同磷源對(duì)菌種產(chǎn)酶的影響分別以 NaH2P04，卩-甘油磷酸鈉或者ATP(含磷量的終 濃度為0.22%)作為唯一磷源，其它元素按發(fā)酵 培養(yǎng)液配方，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種接種于上述培 養(yǎng)基中[11]。
1.5.6酶學(xué)性質(zhì)JP3最適pH及其穩(wěn)定性：在 pH 4. 0?9. 0的緩沖液（pH 4. 0?6. 5為 0.05 mol.L1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 7.0? 8.0為0.05 mo卜L1 \3只？04屮3私？04緩沖液; pH 9. 0為0. 05 mol. L1的甘氨酸-NaOH緩沖 液）中，測(cè)定酶活力[12]。
粗酶液與不同pH的緩沖液（pH 9. 0?10. 5 為0.05 mobL1碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液）于30'C 保溫6 h后，測(cè)定酶活力。
最適溫度和溫度穩(wěn)定性:將反應(yīng)體系于不同 溫度測(cè)定酶活力，研究酶的最適溫度。將酶液在 不同溫度下保溫30 min后測(cè)定酶活力，分析酶的 溫度穩(wěn)定性。
金屬離子對(duì)酶活的影響：在不同金屬離 子(Cu2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Na+、Ca2+ 等）存在 時(shí)測(cè)定酶活(最適溫度，最適pH),以未添加金屬 離子的酶活作為空白對(duì)照（100%)，除Na+為 150 mmobU外，其余的金屬離子濃度皆為IX 10'3mol»L'1[13] „
米氏常數(shù)：以不同濃度的黃原膠作底物，測(cè)定 酶活力，計(jì)算酶反應(yīng)的初速度。每個(gè)樣品做3次 平行測(cè)定，通過反應(yīng)初速度和底物濃度的倒數(shù)作 圖，得到雙倒數(shù)圖。根據(jù)直線在X軸和Y軸的截 距，利用米氏方程可得米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng) 速度 Vmax[14]。..
底物濃度對(duì)酶活性的影響：底物濃度分別為 0.5%、1.0%、1.5%時(shí)發(fā)酵液菌體生長(zhǎng)隨時(shí)間的 變化規(guī)律，搖瓶裝量為30 mL，初始pH為7. 0,接 種量為1. 0%，搖速為200 r.min-1。
42
1.5.7降黏率采用PAHBAH法測(cè)定黏度。 按比例接菌種于300 mL無菌液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié) pH后，測(cè)量初始表觀黏度V。，記錄測(cè)量溫度T。， 放置恒溫?fù)u床培養(yǎng)一段時(shí)間后取出，水浴加熱或 自然冷卻，使溶液溫度恢復(fù)為r。，迅速測(cè)量表觀 黏度V,，繼續(xù)放置搖床培養(yǎng)觀察。用旋轉(zhuǎn)黏度儀 測(cè)量黏度，則降黏率為：W/% = (V。一 W)/ V〇 X 100115]«,
2結(jié)果與分析
2.1菌種的采集和分離及篩選
經(jīng)對(duì)反復(fù)篩選和培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液粘度下降 程度和速度的比較，選出1株對(duì)黃原膠降解能力 最強(qiáng)的菌落，命名為X08a。菌株X08a為細(xì)菌，在 生長(zhǎng)過程中呈桿狀，老齡菌為球形，菌體形態(tài)不規(guī) 則；不形成孢子，革蘭氏染色陽(yáng)性[16]。
2.2菌株X08a黃原膠酶酶活測(cè)定
酶標(biāo)儀測(cè)定〇?40 fxg葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線(見圖1)，得直線方程:V=0.022 7z+0.074 6。
圖1還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖2可知，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基的粘 度迅速下降，黃原膠降解酶活力逐漸上升，二者幾 乎同步變化，說明X08a菌生長(zhǎng)過程中分泌胞外 降解酶將黃原膠降解，提供生長(zhǎng)所需能量。
由圖3結(jié)果可知，以NH4C1作為氮源時(shí)，菌 體酶活力最高。氯化銨來源廣，價(jià)格低，是理想
氮源。
250
圖3不同氮源對(duì)X08a黃原膠酶產(chǎn)嗨的影響
2.4 不同磷源對(duì)菌株X08a黃原膠酶產(chǎn)酶的 彩響
圖4表明，以Na2HP04、(3-甘油磷酸鈉或者 ATP作唯一磷源時(shí)，甘露聚糖酶活性都隨磷源濃 度的增加而逐漸增高。Na2HP04更有利于菌株 X08a生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。
2.5X08a黃原膠酶釀學(xué)性質(zhì)的測(cè)定
圖5表明，該酶最適pH范圍為5?6。菌株 X08a產(chǎn)酶期間以1 h為時(shí)間間隔，分別在不同 pH條件下測(cè)其酶活，可看出3條曲線間距不大， 即不同時(shí)間點(diǎn)的黃原膠酶在相同pH條件下的酶 活差別不大，說明在相同pH條件下這種酶產(chǎn)生 的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)其酶活影響較小。
圖6 X08a黃原膠酶的最適溫度 對(duì)酶活幾乎無影響。說明該酶含有金屬離子，該 金屬離子可能是酶的直接活性中心，也可能是作
為輔基起到輔助性作用（見圖7)。
100
迄80 瀘60 « 40 20
圖7金屬離子對(duì)X08a黃原膠酶酶活的影響
根據(jù)計(jì)算，米氏常數(shù)Km=0.24最
大反應(yīng)速度Vmax=68pmo卜（min*g)_l。表明這 種酶的反應(yīng)速率與酶的濃度成正比(見圖8)。
°3456789 it)
pH
ffl5 X08a黃原膠酶的最適pH
圖6表明，這種酶最適溫度為30?40°C。菌 株X08a產(chǎn)酶期間以1 h為時(shí)間間隔，分別在不同 溫度下測(cè)其酶活，3條曲線的數(shù)值差別較大，即在 不同時(shí)間點(diǎn)的黃原膠酶在相同溫度下的酶活差別 較大，說明在相同溫度下這種酶產(chǎn)生的時(shí)間長(zhǎng)短 對(duì)其酶活有較大影響。I‘
金屬離子Na+、Ca2+和EDTA均顯著降低酶 活。Mg2'Zn2+對(duì)酶活有抑制作用，Cu2+、Mn2+
表1表明，底物濃度在1%時(shí)，黃原膠酶活性 最高。
表1底物濃度對(duì)產(chǎn)醮的彩響
培養(yǎng)時(shí)間/h1.50%底物濃度
2.6降黏率
由圖9可知.隨時(shí)間變化，黃原膠溶液的黏度 逐漸下降，第1天黏度下降32%，第2天變化較
小，第3天有明顯下降，之后黏度緩慢下降。黃成 棟等研究表明，黃原膠分子的降解有主鏈降解和 側(cè)鏈降解2個(gè)過程。主鏈降解對(duì)黃原膠的黏度變 化影響較側(cè)鏈大，但側(cè)鏈的存在阻礙了主鏈的 降解。
圖9黃原膠溶液降黏率的變化情況
3結(jié)論與討論
'該試驗(yàn)分離出了1株產(chǎn)黃原膠降解酶的細(xì)菌 菌株X08a,單位時(shí)間內(nèi)對(duì)黃原膠有較高降粘率。 研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌X08a分泌的黃原膠降解酶對(duì)溫度 敏感性較高，對(duì)pH要求則相對(duì)寬松；通過金屬離 子對(duì)酶活性影響，推測(cè)有二價(jià)的主族金屬離子作 為輔助因子對(duì)酶的活性起作用；通過酶反應(yīng)初速 度（V)與底物濃度（S)之間的關(guān)系可知這種酶的 底物專一性較強(qiáng)。而由該酶降解黃原膠所得到的 寡糖的結(jié)構(gòu)、組成以及可能擁有的生物活性，則有 待進(jìn)一步研究。