光學顯微鏡的出現(xiàn)使得我們能夠觀察到用肉眼看不到物質(zhì)細節(jié)，如生物細 胞，因此它在生物學研宄中已經(jīng)成為一個必不可少的重要工具。普通的光學顯微 受到衍射極限的限制，不可能分辨比A/2(A為光波波長)更小的物體，普通的光學 顯微鏡分辨率的極限只能達到0.3 #。后來發(fā)明的電子顯微鏡雖然具有非常高的

分辨率，但它復(fù)雜的制樣要求限制了其在活性生物分子等方面的研宄應(yīng)用。到了 二十世紀八十年代，Binnig和Rohrer[1]發(fā)明了掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microseope，STM)，使人們可以觀察原子級微觀世界，但是其適用范圍有限。 1986年誕生了原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM) [4]，這種高分辨的

掃描探針顯微鏡能夠應(yīng)用到包括絕緣體樣品在內(nèi)的各種樣品研究中。

2.1.1原子力顯微鏡的工作原理

原子力顯微鏡(AFM)是Binnig等人在STM的基礎(chǔ)上發(fā)明的，它利用原子之 間的范德華力（VanDerWaals Force)來呈現(xiàn)樣品的表面特性。

原子力顯微鏡有一個對力非常敏感的微懸臂，其尖端有一個微小的探針，當 針尖與樣品表面接觸的時候，針尖與樣品表面上的原子之間存在有一個非常微弱 的相互作用力而使微懸臂彎曲，將微懸臂彎曲的形變信號轉(zhuǎn)變?yōu)楣怆娦盘柌⑦M行 放大，就可以得到原子之間力的微弱變化的信號。AFM通過測量探針針尖與樣品 表面原子間力的大小來描繪出樣品的表面形貌，它不受樣品是否具有導電性的限 制，可以測量導體、半導體和絕緣體，因此AFM的出現(xiàn)補償了 STM不能觀測絕 緣體的缺陷，為生命科學領(lǐng)域的發(fā)展做出了很大的貢獻。圖2-1為AFM工作原 理及儀器結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2-1 AFM工作原理示思圖 Fig.2-1 Schematic of working principle of AFM

2.1.2原子力顯微鏡的工作模式

根據(jù)掃描方式的不同，AFM成像有兩種模式，一種是恒力模式，一種是恒高 模式。在掃描的過程中，恒力模式的探針與樣品表面之間的相對距離保持不變， 即是原子間的作用力保持不變，如圖2-2(a)，恒高模式是保持探針針尖的高度 保持不變，如圖2-2(b)。

圖2-2 AFM的兩種探針掃描方式:a)為恒力或恒流方式，b)為恒高方式

Fig.2-2 Schematic diagram of two operating modes of AFM: a) constant force mode,b)constant height mode

根據(jù)原子間之間的作用力（引力或斥力）的不同，AFM成像模式又分為接觸模 式(Contact mode AFM，C-AFM)、非接觸模式(Non-Contact mode AFM，NC-AFM)

河南大學光學專業(yè)2006級碩士論文

和輕敲模式（Intermittent-contact(tapping mode) AFM，TM-AFM)三種工作模式，如

圖2-3。

Contact. ModeNoncontact. ModeT appinp Mode

rf -

1 0

Elesuiting image profiles

圖2-3AFM工作模式和得到的形貌輪廓a接觸模式b非接觸模式c輕敲模式 Fig.2-3 AFM working modes and resulting image profiles.a) contact mode，b) non¬contact mode c) intermittent-contact(tapping mode)

接觸模式中，針尖和樣品表面之間的距離是幾個埃，針尖與樣品之間的作用 力在范德華力的排斥區(qū)域內(nèi)。非接觸模式中，針尖與樣品表面之間的距離是50- 100埃，針尖與樣品之間的作用力在范德華力在吸引力區(qū)域內(nèi)。當針尖與樣品之 間的作用力在范德華力的吸引力和排斥力區(qū)域之間的時候，此工作模式被稱為輕 敲模式，針尖與樣品表面之間的距離大約是10-50埃。圖2-4為原子間的 Lennard-Jones曲線，在圖中我們可以看出有三個區(qū)域：（1)接觸區(qū)域，代表的是 AFM接觸模式;2)非接觸區(qū)域代表AFM非接觸模式；3)在接觸區(qū)和非接觸區(qū)兩 者之間區(qū)域，代表TM-AFM模式。

接觸模式下，針尖前端的單個原子與樣品表面的單個原子之間存在排斥力， 敏感的微懸臂因為排斥力發(fā)生彎曲。利用這一點可以測量出原子間接近時的相互 排斥力，一般可以測得兩個原子之間的力為1〇-8N左右。接觸的情況下由于摩擦 力的存在可以引起懸臂的偏轉(zhuǎn)，不同的摩擦力使懸臂的偏轉(zhuǎn)不同，運用該特點可 以來檢測針尖與樣品表面之間摩擦力的大小，一般可以測得摩擦力的大小1〇-11N 左右。由于針尖與樣品的接觸比較近，成像的分辨率高。但是如果掃描的樣品比 較軟的情況下，針尖和樣品表面強的排斥力會造成樣品原子位置的改變，引起軟 樣品的損傷；同時，軟樣品的原子容易粘附在探針針尖上，污染針尖不利于成 像，所以接觸模式下一般不對軟樣品進行掃描，研宄生物大分子、低彈性模量樣 品以及容易移動和變形的樣品不能用接觸模式。

非接觸模式下針尖與樣品表面表面之間是不接觸的，相互作用力也比較小。 這樣小的力有利于研宄軟的或生物樣品。但此時針尖與樣品之間的距離較遠，分 辨率要比接觸模式和輕敲模式都低，而且成像不穩(wěn)定，操作相對困難，在生物中 的應(yīng)用也比較少，此模式一般比較少用。

處在兩者之間的被稱為輕敲模式(Tapping mode AFM，TM-AFM)。輕敲模式 類似于非接觸模式，只是輕敲模式下的微懸臂的共振頻率的振幅振動比較大，一 般在20nm左右，AFM的針尖在振蕩的時候與樣品的表面只是輕輕接觸，因此被 稱作輕敲模式。由于輕敲模式能夠避免針尖粘附到樣品上，以及在掃描過程中對 樣品幾乎沒有損壞，針尖與樣品的剪切力更小，對樣品的損傷也更小，所以在液 體中的輕敲模式成像可以對活性生物樣品進行現(xiàn)場檢測、對溶液反應(yīng)進行現(xiàn)場跟 蹤等。

在空氣中進行成像的時候，對于一般的無機材料等剛性物質(zhì)，一般采用接觸 模式。對于生物樣品、軟的或彈性樣品，通常采用用非接觸模式或輕敲模式，原 因如下：（l)掃描時針尖一樣品間作用力較小，且消除了側(cè)向力（如摩擦力和拉 力），不會使樣品變形，可以進行自然狀態(tài)的觀察；（2)當空氣中的濕度較大時 (RH>65%)，樣品表面會形成一層水膜，并且這層水膜對針尖的毛細作用力遠超

過其它作用力，它會使AFM圖像變形或者不能成像，從而嚴重影響成像的分辨 率。在非接觸模式或輕敲模式中，毛細作用力對針尖的作用明顯減小，對圖像影 響較。在我們進行試驗的時候經(jīng)常采用的是輕敲模式。

在近生理溶液中成像，一般采用用接觸模式模式。因為近生理溶液中不存在 毛細作用力的影響，因而接觸模式能很好地控制針尖與樣品間的相互作用力。倘 若在溶液中用非接觸模式，針尖所施加的側(cè)向力雖然減小，但是溶液的存在使得 探針在不接觸樣品時難以測得準確的高度值，在形貌成像中，分辨率非常差。另 外，非接觸模式很容易引起液體的波動，導致分辨率降低。近期來已經(jīng)發(fā)展的一

種新型輕敲模式磁驅(qū)動輕敲模式（MAC )，他的工作原理是通過交變磁場

來直接驅(qū)動背面鍍有磁膜的微懸臂，可以很大的提高輕敲模式的實效性，特別是在 液體情況下，它可以實現(xiàn)對微懸臂的非常精確的控制，在掃描成像中，可以使用力 常數(shù)更小的微懸臂及更小的驅(qū)動力，因此大大提升了輕敲模式在生理環(huán)境下對生 物樣本成像的優(yōu)勢。我們實驗中采用了磁驅(qū)動輕敲模式成像，并得到了很好的成 像效果。