木質(zhì)纖維是自然界最豐富的可再生資源，占整個植物細(xì)胞千重的90%以上。不同植物中木質(zhì)纖維素酶各種組分的含量是不同的，軟木中的木質(zhì)素 含量比硬木高，草中的纖維素含量最高。一般來說, 木質(zhì)纖維素中含纖維素45%、半纖維素30%和木 質(zhì)素25%[1]。其中含量最高的纖維素必須通過纖維 素酶的作用分解成還原糖的形式方可用于乙醇發(fā) 酵等領(lǐng)域[2]。然而，就目前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，纖 維素酶活力不高是限制木質(zhì)纖維資源利用的主要 因素[3],所以選育高產(chǎn)纖維素酶的菌種是關(guān)鍵所在。 產(chǎn)纖維素酶的生物種群十分廣泛，如細(xì)菌、真菌、 放線菌及昆蟲、軟體動物和原生動物等,而目前 主要是利用細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物發(fā)酵來 獲得纖維素酶[4]。細(xì)菌類包括纖維黏菌屬、纖維 桿菌屬和芽孢桿菌屬等；放線菌包括鏈霉屬、高 溫放線菌屬和彎曲熱單胞菌等；真菌類包括木霉

屬、曲霉屬、青霉屬、漆斑霉屬、孢霉屬等[5]。 本研究從自然界篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的真 菌，經(jīng)鑒定為鐮刀菌屬，拓寬了產(chǎn)纖維素酶的真 菌屬種，為木質(zhì)纖維的降解提供了參考。

1材料與方法

1.1實驗材料 1.1.1樣品

采集地點為湖北省神農(nóng)架保護(hù)區(qū)，具體采樣 地點包括大龍?zhí)丁Ⅷ喿涌?、板壁巖等地，樣品均 為森林腐質(zhì)土壤。稻草粉，收集長沙縣脫谷稻草 秸稈，剪成3 cm片段，烘干后用微型植物粉碎機(jī) 粉碎至30?120目。

1.1.2培養(yǎng)基

① CMC-Na 培養(yǎng)基：CMC-Nal5g，NH4N03 lg，酵母膏 lg，MgSO4_7H2O0.5g，KH2P04lg， 去離子H20 1 000 mL,瓊脂2%, pH自然。②剛 果紅纖維素鑒定培養(yǎng)基：（NH4)2SO40.2%，MgS04 ■7H20 0.05%, K2HP〇4〇.1%, NaCl 0.05%, CMC- Na2.0%g,剛果紅 0.02%,瓊脂 2.0%, pH 自然。 ③濾紙液體培養(yǎng)基：濾紙2 g, NH4N03 1 g,酵母 膏 1 g, MgS04,7H20 0.5 g, KH2P04 1 g,去離子 H20 250 ml。④液體產(chǎn)酶鑒定培養(yǎng)基[<s]:蛋白胨3 g， 酵母膏 0.2g，（NH4)2S042 g，KH2P044 g，CaCl2 •2H20 0.3 g, MgS04-7H20 0.3 g, CMC-Na 10 g, 去離子H20 1 000 mL, pH自然。⑤種子培養(yǎng)基： 葡萄糖20 g/L，蛋白胨1 g/L, Mandels營養(yǎng)鹽濃 縮液100 ml/L, Mandels微量元素濃縮液1 ml/L，

1 mol檸檬酸緩沖液50 ml/L。

1.2分析方法

1.2.1初篩方法

利用CMC-Na培養(yǎng)基獲得純菌落，用1 mg/ mL的剛果紅溶液染色30min[7]，再用蒸餾水清 洗，最后用1 mol/L的NaCl溶液脫色30 min。以 透明圈的直徑和菌落直徑的比值大小作為篩選的 標(biāo)準(zhǔn)，將篩選到的菌株接種到濾紙液體培養(yǎng)基中， 28°C, 180r/min,以不接種住何菌株的濾紙液體 培養(yǎng)基作為空白對照，重復(fù)3次實驗，以濾紙的 失重率作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)，XKw-wO/w，其中w 為最初濾紙質(zhì)量，降解后濾紙經(jīng)烘干后的質(zhì)量。 1.2.2復(fù)篩方法

將初篩得到的幾株菌按5%的接種量接種到液 體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28°C, 180 r/min，振蕩培養(yǎng)5天后， 將培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min,取其上清液測

定酶活（FPA酶活、CMC酶活）大小。

1.2.3酶活測定[8]

FPA酶活：取四支試管，將裁剪成50±0.5 mg濾紙條折成M形沿豎直方向推到試管底部，加 入0.05 mol pH4.8檸檬酸緩沖液1.5 mL，待測酶液 0.5mL (空白管不加），充分混勻后于50°C水浴 放置60 min,迅速向各管加入DNS試劑3 mL, 空白管加酶液0.5 mL,沸水浴放置10 mim冷卻 后定容至25mL,用空白管調(diào)零，540nm測定0D 值，以吸光度平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖含量。

CMC酶活：取4支試管，分別加入用0.05 mol pH4.8檸檬酸緩沖液配置的CMC-Na液2 mL,待測酶液0.5mL (空白管不加），充分混勻 后于50°C水浴放置30 min,迅速向各管加入DNS 試劑3 mL,空白管加酶液0.5 mL,沸水浴放置10 min，冷卻后定容至25 mL,用空白管調(diào)零，540 nm測定OD值，以吸光度平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 還原糖含量。

上述酶活測定，反應(yīng)后均用DNS法測定酶解 產(chǎn)生的還原糖量，酶活單位采用國際單位，lmL 酶液1 min分解底物生成1 nmol葡萄糖的酶量定 義為1個酶活單位，以IU/mL表示。

1.2.4形態(tài)鑒定

將菌株接種到PDA平板上，培養(yǎng)3天，觀察 菌落的特征。在平板上挑菌體少許，涂于載玻片上， 乳酸石碳酸棉蘭染色液染色后置于顯微鏡下觀察 (水浸片法），參照《真菌鑒定手冊》[9]進(jìn)行菌 種鑒定。

1.2.5 18SrDNA序列鑒定

100 mg菌絲樣品于液氮中研磨至粉末，保存 于1 mL離心管中[1°]。利用酵母總DNA提取試劑 盒（天根生化科技有限公司）提取菌株總DNA, 采用 ITS 1 (5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG- 3，）和 ITS4 (5’-TCCT CGCC TTAT TGAT ATGC- 3')弓丨物擴(kuò)增菌株18SrDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)[11]。PCR 反應(yīng)體系為50 pL，程序為：94°C預(yù)變性5 min， 94。(：變性5〇8，51°(：退火5〇8,72°(：延伸2 111111, 30個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊 脂糖電泳檢測后送北京六合華大基因公司測序， 于NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對分析。

1.2.6產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

首先進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)基單@素試驗，保持培養(yǎng) 基中其他成分不變，分別改變其中的碳源、氮源、 初始pH和表面活性劑（鼠李糖脂）[12]這4個因素， 篩選出影響B(tài)-5菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳單因素。 然后設(shè)計4因素3水平正交試驗[13]，確定產(chǎn)纖維

120

陸晨，等：一株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

第6期

素酶的最優(yōu)組合。

2結(jié)果與分析

2.1初篩結(jié)果

利用CMC-Na培養(yǎng)基分離得到9株形態(tài)不同 菌種，有細(xì)菌、放線菌和真菌。剛果紅染色，均 產(chǎn)生大小不一水解圈，其中B-5菌株水解圈直徑 與菌落直徑比值并不是最大，見圖1。將分離得到 9株菌接種到濾紙液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后，測定濾 紙失重率，其中接種B-5的培養(yǎng)基中濾紙條被崩 解成不規(guī)則小片，整個培養(yǎng)基成糊狀，見圖2,濾 紙失重率為最大，達(dá)37.9%»

表1各菌株酶活大小

Table 1 Cellulase activity of each strain IU/mL

菌株A-lA-2A-3A-4B-lB-2B-3B-4B-5

FPase1.330.890.561.140.610.731.061.152.09

CMCase3.841.560.782.450.591.062.141.185.20

2.3形態(tài)鑒定

PDA培養(yǎng)基28°C條件下培養(yǎng)4天后菌落直徑 達(dá)到3 cm左右，菌落起初呈粉白色，4°C保藏10 天后局部呈淡黃色，見圖3。菌落表面附著孢子， 絨毛狀。顯微鏡下觀察，菌絲纏繞抱團(tuán)，由單細(xì) 胞鏈接而成，見圖4。通過菌落和菌絲特征，推測 其為一株真菌。

 

2.2復(fù)篩結(jié)果

對于以上9株菌均進(jìn)行了產(chǎn)酶實驗，它們的 FPA酶活和CMC酶活見表1,可見B-5的FPA酶 活和CMC酶活均最高。

獲得B-5菌總DNA模板后，利用ITS引物在 4個退火溫度梯度下（51X：、53T、551、57X：) 進(jìn)行PCR反應(yīng)，均得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，大小700 bp左右，見圖5»測序拼接后登陸Genebank進(jìn)行 Blast比對，確定其為鐮刀菌屬，與木賊鐮刀菌同 源性達(dá)99%»

2.5 B-5鐮刀菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.5.1不同碳源對產(chǎn)酶活力的影響

由圖6可見，利用CMC-Na為唯一碳源時， FPA酶活和CMC酶活均最高（2.09 IU/mL和5.20 IU/mL)，但稻草秸稈是天然可再生資源，并且作 為農(nóng)業(yè)廢物利用率較低，在實際應(yīng)用方面具有優(yōu)

勢，故選取稻草作為唯一碳源進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化。 2.5.2稻草添加量對FPA酶活力的影響

由圖7可見，當(dāng)?shù)静萏砑恿吭?.5%?2.5% 之間時，隨著稻草添加量的增加，酶活不斷升高。 當(dāng)?shù)静萏砑恿繛?.5%時，F(xiàn)PA酶活最高為1.841 IU/mL.

2.5.3蛋白胨添加量對FPA酶活力的影響

由圖8可見，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿吭?2%?0.8%之 間時，隨著蛋白胨添加量的增加，酶活不斷升高。當(dāng) 蛋白胨添加量為0.8%時，酶活最高為1.863 IU/mL。 2.5.4初始pH值對FPA酶活力的影響

保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不變，當(dāng)培養(yǎng)基的初始 pH值在酸性環(huán)境下逐漸升高時，酶活也不斷升高。 當(dāng)初始pH值為6.1時FPA最高為1.875 IU/mL， 見圖9。

2.5.5表面活性劑對FPA酶活力的影響

保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不變，分別添加〇%、 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5% 的鼠李糖月旨（購 買的制劑，鼠李糖脂含量為50%?60%)。當(dāng)鼠 李糖脂添加量為0.1%時，F(xiàn)PA酶活最高為2.067 IU/mL,見圖 10。

圖6不同碳源對FPA_活力和CMC酶活力的影響 Fig.6 Effects of different carbon sources on FPase and CMCase

以.5.0.5 jl.1..0.

(--1)/胺謐

.0.5.0.5 2.1.L0.

(Ils.m)/ifi«

 

圖7不同稻萆添加量對FPA酶活力的影響 Fig.7 Effects of different rice straw content on FPase

〇.%.00.20.40.6- 0.81.01.21.4

蛋內(nèi)胨添加量

圖8不同蛋白胨添加量對FPA酶活力的影響 Fig.8 Effects of different amount of peptone on FPase

("?31)/餌避

-,15*01)/餌讞

•

°'3.03.54.04.55.05.56.06.57.0

初始pH值

圖9不同初始pH值對FPA酶活力的影響 Fig.9 Effects of different initial pH value on FPase

2.5.6產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化實驗

在以上單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取培養(yǎng)基初 始pH、氮源（蛋白胨）、碳源（稻草）和表面活 性劑（鼠李糖脂）這四個因素作為B-5鐮刀菌產(chǎn)酶 過程中培養(yǎng)基優(yōu)化的因素，設(shè)計四因素三水平的 正交試驗如表2,試驗結(jié)果見表3。

表2正交試驗設(shè)計

Table 2 Orthogonal experimental design

水平因素

初始pH值氮源p/%碳源p/%表面活性劑P/%

14.80.620.1

25.50.82.50.2

36.11.03.00.3

表3正交試驗結(jié)果 Table 3 Orthogonal test results

因素初始pH值氮源

p/%碳源

p/%表面活性劑

p/%酶活

/(IU-mL-1)

111111,257

212221.859

313331.791

421231.675

522312.042

623121.605

731321.562

832131.831

933212.205

4.9074.4944.6935.504

K25.3225/7325.7395.026

5.5985.6015.3955.297

R0.6911.2381.0460.478

各因素對FPA酶活影響的大小順序為氮源> 碳源 > 初始pH值> 表面活性劑。從試驗結(jié)果中得 出最優(yōu)組合：初始pH為6.1，氮源濃度為1.0%, 碳源濃度為2.5%,鼠李糖脂添加量為0.1%,酶活 最高為 2.205 IU/mL。

° 0.00.10.20.30.40.50.6

鼠李糖脂添加量

圖10不同鼠李糖脂添加量對FPA酶活力的影響 Fig.10 Effects of different rhamnolipid content on FPase

3結(jié)論

本研究從原始的自然環(huán)境采集樣品，利用剛 果紅染色和濾紙崩解等基礎(chǔ)方法分離篩選出產(chǎn)纖 維素酶的菌種9株。鑒于細(xì)菌、放線菌和真菌的 生長形式不同，剛果紅染色產(chǎn)生水解圈的大小并 不能作為其產(chǎn)纖維素酶活力高低的唯一標(biāo)準(zhǔn)，于 是利用濾紙的崩解效率進(jìn)行反復(fù)驗證。最后精確 測定FPA酶活和CMC酶活確定產(chǎn)酶最優(yōu)的菌種 B-5。菌種鑒定時，首先通過觀察菌落形態(tài)和菌 絲結(jié)構(gòu)基本確定其為一株真菌，然后利用酵母總 DNA提取試劑盒提取其總DNA作為模板，通過 ITS1和ITS4引物擴(kuò)增其18SrDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)， 在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對確定其為一株鐮 刀菌。在產(chǎn)酶優(yōu)化實驗中，將FPA酶活力（全酶活) 大小作為唯一標(biāo)準(zhǔn)，確定最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：稻草 粉末 25g/L,蛋白胨 10g/L, KH2P042g/L, CaCl2 •2H20 0.4 g/L, MgS04-7H20 0.02 g/L, Mandels 微量元素濃縮液1 mL/L, 1 mol檸檬酸緩沖液50 mL/L，鼠李糖脂添加量0.1%, pH為6.1。FPA酶活 為 2.205 IU/mL,相應(yīng) CMC 酶活為 5.174 IU/mL»

鐮刀菌通常作為植物甚至農(nóng)作物的致病菌進(jìn) 行研究[14]，在原始森林中篩選出的B-5鐮刀菌具 有較高產(chǎn)纖維素酶能力，利用稻草作為碳源時有 良好的產(chǎn)纖維素酶效果。雖然酶活離預(yù)期還有一 段距離[15]，但是通過其它的條件優(yōu)化仍有提高潛 力，本研究不僅拓寬了產(chǎn)纖維素酶的菌譜，也為 尋求稻草秸稈新的利用途徑做出了貢獻(xiàn)。