能夠降解纖維素的微生物很多，可是目前的分離篩選研究卻大多數(shù)集中在有限的幾個菌株上，如康寧木霉，里氏 木霉等，然而這些菌株仍然存在著產(chǎn)酶成本高，酶活性 不穩(wěn)定，作用pH范圍狹窄等問題。要想更好的應(yīng)用微 生物的降解功能，需要在菌種篩選和反應(yīng)條件方面更 深入研究。
1材料與方法 1.1試驗時間、地點研究試驗于2007年在西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科 學(xué)學(xué)院微生物研究室進(jìn)行?
1.2試驗材料1.2.1試驗樣品腐爛秸桿取自楊凌張家港村田間;牛 糞取自張家港村個體養(yǎng)殖戶；標(biāo)準(zhǔn)木霉菌種來源于西 北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院微生物實驗室。
1.2.2 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基 P>[g/L]:Na2HPO44.0g， KHm 2.0g，NaCl 0.5g，NH4NO3 0.5g，MgSO4 .71120 O.Olg (NH4) 2S04 0.4g, KNOj 0.4g, CMC-Na 30.0g.
純化培養(yǎng)基査氏)[g/L]:纖維素（濾紙)30g， NaN03 2g，F(xiàn)eS04 O.lg’KjHPO* 0.5g，KCl 0.5g,MgSCV 7H2O0.5g，蔗糖 30g,瓊脂 15g。
初篩培養(yǎng)基[51(瓊脂糖平板）[g/L]:磷酸氫二鉀一 檸檬酸緩沖液500ml, CMC-Na 0.5g,瓊脂7.5g。
復(fù)篩培養(yǎng)基w [g/L]: CNH4>2S04 lg,0.44g/L ZnS04 5ml,K2HP04 0.1g,0.1g/L MnS04 5ml,FeS〇4 2.5mg> KH2P04 0.4g，CaCl210mg，酵母育 0.5g,MgS04 0.45g, 蛋白胨lg,0.01g/L維生素B, 10ml稻草粉1.5g。
1.2.3試劑3,5—二硝基水楊酸(DNS)溶液，磷酸氫二鉀一檸 檬酸緩沖液，新華1號濾紙。
1.3試驗方法1.3.1窗集培養(yǎng)先將采集回來的樣品用三角瓶溶解。 將三角瓶置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱30*0180r/min下培養(yǎng) 24h。分別經(jīng)過連續(xù)3次富集培養(yǎng)，以使纖維素分解菌 達(dá)到一定濃度，衡量標(biāo)準(zhǔn)即培養(yǎng)基黏度明顯減低。
1.3.2純化經(jīng)過富集培養(yǎng)，取菌液在無菌操作下進(jìn)行 涂布分離，在SO。下溫箱培養(yǎng)5d。由于菌液濃度過高， 菌較為密集且小，并將劃線后的培養(yǎng)皿置于3010培養(yǎng) 箱進(jìn)行純化培養(yǎng)。經(jīng)過幾天培養(yǎng)后，再將純化后的單菌 落進(jìn)行斜面培養(yǎng)。
1.3.3初篩（瓊脂糖透明圈法)在無菌操作下，將純化 斜面培養(yǎng)的降解菌點接到培養(yǎng)基中，每種菌做2個重 復(fù)。置于301培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，并不斷觀察，待菌落 成型后染色。
染色：用0.2%剛果紅染色30min,并依次用蒸餾 水和lmol/LNaCl徹底洗去染液，然后用5%醋酸液固 定顏色5min。觀察透明圈大小并測量。
1.3.4纖維素酶特性的測定3-5二硝基水楊酸法(DNS 法)"酶液制備：將初篩選出的菌株分別接入1_無 菌水中，搖勻，再各吸取10ml加入復(fù)篩培養(yǎng)基中，在 28XM60r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)。同時作木霉對照組。從 各菌株搖瓶培養(yǎng)基中分別取20ml發(fā)酵液，加入離心管 中，3000r/min離心10min。完畢后取上清液備用。纖維 素酶活力單位，采用國際單位(U),即在lmin內(nèi)使底 物生成葡萄糖所需的酶量定義為lU?。
濾紙崩潰度測定：在試管中加入檸檬酸緩沖液 lml,酶液4ml及l(fā)cmx3cm濾紙1張，搖勻，使濾紙全 部浸入溶液中。然后將試管放入4(TC恒溫水中保溫 2h,取出后觀察濾紙崩潰情況(將手指按住管口，把試 管顛倒1次),記錄結(jié)果。
濾紙酶活力(FPA)測定％將濾紙定量(lcmx6cm) 卷成筒狀放入試管中，加入1.0ml 0.05M pH4.8檸檬 酸一檸檬酸鈉緩沖溶液和0.5ml稀釋了 10倍的酶液， 在水浴鍋中5(TC保溫lh,采用DNS法測定還原糖的 生成量。
羧甲基纖維素酶活力(CMCA)測定A反應(yīng)體系為 1.0ml 1%CMC-Na溶液，0.5ml稀釋10倍酶液，水浴 鍋50X：保溫0.5h,采用DNS法測定還原糖生成量。 1.3.5碳源、氮源篩選碳源的篩選：氮源選擇硫酸 氨，用葡萄糖、濾紙、麩皮代替羧甲基纖維素鈉鹽。發(fā) 酵培養(yǎng)基仍為復(fù)篩培養(yǎng)基(其中蛋白胨視為提供生長 因子物質(zhì)，而將硫酸氨看作氮源，羧甲基纖維素鈉鹽 視為碳源），pH,培養(yǎng)溫度和時間同復(fù)篩條件，做木霉 參考組。
氮源的篩選：碳源選擇羧甲基纖維素鈉鹽，用硝 酸銨、蛋白胨、硝酸鉀代替硫酸氨。培養(yǎng)基依舊選用 復(fù)篩培養(yǎng)基，其余發(fā)酵條件同復(fù)篩情況，亦做木霉參 考組?
1.3.6最適pH值的篩選將待研究的菌株在其各自2.2初篩的最適碳源，氮源條件下(其余成分不變)，將pH依次 調(diào)整為4、5、6、7、8、9六個梯度，于28*C恒溫?fù)u床培養(yǎng) 1周左右，測定其各自的CMC酶活力、FPA酶活力。 1.3.7培養(yǎng)時間對酶活力影響的測定在各自最適碳 源、氮源及pH值條件下，將待測各菌株及其混合菌群 于28°C下恒溫?fù)u床培養(yǎng)，以天為單位進(jìn)行每日跟蹤測 定CMC酶活力、FPA酶活力。記錄數(shù)據(jù)后，繪制酶活 隨天數(shù)變化曲線。
1.3.8纖維素分解菌形態(tài)的觀察用壓片法w制片后鏡 檢。
2結(jié)果與分析2.1富集、純化經(jīng)過富集、分離純化后得到9株在分離培養(yǎng)基上 生長速度快，旺盛的菌株，分別命名為F-1?F-9。
根據(jù)剛果紅透明圈直徑大小與菌落直徑的比值和 該酶活成正比的原理進(jìn)行初篩，結(jié)果見(表1)?
考慮木霉參考樣情況，結(jié)合各菌水解效果，共選出 6株真菌進(jìn)入下一輪復(fù)篩，分別為F-l，F(xiàn)-2,F-3,F-5, F-6，F(xiàn)-8。
2.3復(fù)篩纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖、葡萄糖等 還原糖能將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸(DNS) 還原，生成棕紅色糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例 關(guān)系，利用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖 維素酶的活力。結(jié)果見(表2)。
綜合考慮，選取F-1和F-6菌株進(jìn)行后續(xù)研究。
2.4碳源、氮源對纖維素腌產(chǎn)董的影響改變不同碳氮源后所測得的酶活結(jié)果見(表3)。
表1剛果紅培養(yǎng)基水解情況D(cm)F-1F-2F-3F-4F-5F-6F-7F-8F-9D1.605.400. 200.142. 258. 500.073.360. 53d0.533.240.090. 670.944. 720.071.200.24D/d3.01.72.30.212.41.81.02,82.2表2苗株濾紙崩漬度及酶活F-1F-2F-3F-5F-6F-8濾紙崩潰度+++-++-CMC 酶活(IU)58.057.0■-82.4-注：（1)崩潰度測定時，是以空白(即不加酶液樣品)為對照進(jìn)行比較得出(符號意義一：無變化邊緣毛糙，膨脹++:有潰爛跡象，彎曲)* (2)酶液稀釋倍數(shù)應(yīng)按實際的酶活大小確定，本次試驗通過對木霉預(yù)試驗初步定為5倍。
表3不同碳源，氮*情況下F-l、F-?的產(chǎn)酶效果硝酸銨蛋白胨硝酸鉀葡萄糖纖麩皮F-1F-6F-1 F-6F-1F-6F-1 F-6F-1F-6F-1 F-6CMC 酶活(IU)87.591.854.5 -84.263.6- -100.6144.7- -FPA_ 活(IU)-27.724.9 -24.030.0- --24.534.8 25.9硝酸銨蛋白胨 m酸鉀葡萄糖 濾紙 鈇皮 圍2不兩碳源、氮湎情況下F-1和F-6的FPA酶活力比較由以上結(jié)果結(jié)合柱狀圖1和圖2分析可知，纖 維素分解菌對不同碳源，氮源的利用率差異是非常 大的。碳源方面，F(xiàn)-1菌株在以濾紙為碳源時，CMC 酶活力最高，其余兩者均較小。而在麩皮為碳源時， FPA酶活力最高，其余兩者均較小，說明濾紙，麩皮 類物質(zhì)對產(chǎn)纖維素酶具有良好的誘導(dǎo)作用。而葡萄 糖盡管能為菌株提供良好的營養(yǎng)物質(zhì)，但是不利于 誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶。另外，對同一種碳源物質(zhì)2種酶 活力不相符，例如F-1株在濾紙為碳源時，CMC酶 活很大，而FPA酶活卻為零，這種情況有待進(jìn)一步 探索。F*6菌株在濾紙培養(yǎng)時，酶活力最髙，且2類 酶活較統(tǒng)一。氮源方面，兩者在氮源為硝酸銨時，均 表現(xiàn)出較髙CMC酶活力，其余氮源較低，說明加入 硝酸銨具有明顯促進(jìn)作用。同樣，F(xiàn)-1菌株表現(xiàn)出2 種酶活力不相符的地方，如在硝酸銨為氮源時' CMC酶活很大，而FPA酶活卻為零。所以，F(xiàn)-1和 F-6菌株的適宜碳源均為濾紙，兩者適宜的氮源皆 為硝酸銨。
2.5最適pH值的篩選最適pH值的篩選結(jié)果見(表4)。
表4不同pH值下F-1和F-6的產(chǎn)酶效果pH 4pH 5PH6pH 7pH i3pH 9F-1F-6F-1F-6F-1F-6F-1F-6F-1F-6F-1 F-6FFA (IU)----25.4---26.4■-- -CMC(IU)41.844.262.161.672.986.566.7112.948.071.343.6 51.1圖3 pH值對F-1和F-?酶促反應(yīng)的彩響由于FPA酶活力太低，所以選擇CMC酶活力作值時，曲線明顯下降，且較快。F-6菌株在pH值4?5.5圖?由圖3可以看出，F(xiàn)-1菌株在pH值4?6.5呈現(xiàn)明呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，當(dāng)pH為6時有最大值，但再升顯的上升趨勢，當(dāng)pH為7時有最大值，但再升髙pH髙pH曲線則呈現(xiàn)下降趨勢。所以，對于兩種菌株的較o^^so^o^o1 ^ 決毪 7e5^3 1*SI)S5饈 3H319.5植適pH值，其范圍均在6?7之間。
2.6培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶作用的影響培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶作用的影響，結(jié)果見(表5、表6)。 對于F-1菌株，在最初的1?4d其酶活力均較低，這可 能是因為菌株被接種到液體培養(yǎng)基后有一段時間的適 應(yīng)期，在此時期內(nèi)，菌株產(chǎn)酶能力較弱，4d后酶活力上 升很快，7d左右可達(dá)最大值，當(dāng)培養(yǎng)時間超過8d時， 菌株產(chǎn)酶能力迅速下降，這可能與底物濃度以及代謝 產(chǎn)物的抑制作用有關(guān)。對于F-6菌株，在最初的1?2d 其酶活力均較低，3d后酶活力上升很快，在7d左右可 達(dá)最大值，但當(dāng)培養(yǎng)時間超過8d時，菌株產(chǎn)酶能力迅 速下降，跌落到最初水平，較之F-1曲線變化更劇烈。 對于F-1和F-6的混合菌群，在最初的1?2d內(nèi)其酶 活力也是較低，3d后酶活力上升很快，在6d左右可達(dá) 最大值，可能是由于兩者間酶系相互補充，才導(dǎo)致髙峰 期提前出現(xiàn)，但當(dāng)培養(yǎng)時間超過7d時，菌株產(chǎn)酶能力表S不同培養(yǎng)時間下F-1的產(chǎn)酶效果Id2d3d4d5d6d7d8d9dlOdFPA 酶活(IU)---_-25.526.626.1-CMC 酶活(IU)0.041.646.250.360.376.5 ,96.289.054.748.5表6不同培養(yǎng)時間下F-6的產(chǎn)鴯效果Id2d3d4d5d6d7d8d9dlOdFPA_ 活(IU)兩---25.426.627.026.2--CMC*活(1叻42.444.754.463.682.9111.6129.5120.666.751.8迅速下降，甚至低于兩者單獨存在時產(chǎn)酶曲線。
由圖4可以看出，對于F-1菌株和F-6菌株兩者 的最適產(chǎn)酶時間出現(xiàn)在第7天左右，而混合菌群在發(fā) 酵的第6天左右就出現(xiàn)了產(chǎn)酶髙峰期。
2.7菌株的鑒定F-1菌株。?菌落較大，質(zhì)地略致密，棉絮狀;外觀干 生出;頂端生排列成帚狀的間枝，分枝多次，頂層為小 梗;分生孢子串呈不分枝的鏈狀，單個孢子為楠圓形。初 步鑒定為頭抱霉屬(cephalosporium cordd)，見(圖5) ?
? F-6菌株：菌落較大，質(zhì)地疏松;外觀干燥，呈現(xiàn)蛛網(wǎng) 狀;表面粉粒狀。菌絲有橫隔膜，分生孢子梗從菌絲垂直 生出;分生孢子串呈不分枝的鏈狀，孢子為橢圓形，初步3結(jié)論3.1該研究共分離純化后得到9株纖維素分解菌進(jìn)入 初篩，經(jīng)過復(fù)篩獲得2株最優(yōu)良的菌株F-1和F*6菌 株進(jìn)行后續(xù)研究。
3.2產(chǎn)酶條件研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-1和F-6菌株的適宜碳源均 為濾紙，適宜的氮源皆為硝酸銨，適宜pH值范圍在 6?7之間，最適產(chǎn)酶時間出現(xiàn)在第7天左右?
3.3 2株菌通過形態(tài)觀察初步鑒定為頭孢霉屬。