鞘氨醇單胞菌XT-11 Sphingomonas sp.是一種新發(fā)現(xiàn)的可專一性降解黃原膠的細菌[1]，具有一 定的工業(yè)應用前景。關(guān)于細菌可以凝集紅細胞的研究已有報道，如Brucella sp.是一種革蘭氏陰性菌， 它可以凝集人血紅細胞，可使哺乳動物和人傳染上地中海熱并導致死亡[2]。另一種革蘭氏陰性菌人 胃幽門螺旋桿菌Helicobacterpylori也可凝集人血紅細胞[3]。紅細胞凝集活性測試方法廣泛用于鑒定一 些細菌致病過程中的“鎖鑰”結(jié)構(gòu)。動物紅細胞的表面存在著各種各樣的糖蛋白和糖脂，因而使其 成為一種用于鑒別細菌粘附類型的工具[4]。本試驗中，筆者采用血凝試驗和血凝糖抑制試驗，測定 了鞘氨醇單胞菌XT-11菌懸液對人和動物紅細胞的凝集活性，以及溫度、pH及Ca2+對菌懸液凝集 活性的影響，旨在了解該細菌的粘附類型，為深入開展細菌凝集素分子水平的研究提供依據(jù)。
1材料和方法1.1材料試驗用菌種系從大連灣灘涂中分離得到的，為兼性厭氧菌。人的B型血樣和小鼠由大連醫(yī)科大 學提供，動物血樣取自大連市長興農(nóng)貿(mào)市場。試劑黃原膠、酵母浸出粉、瓊脂粉、蛋白胨、胰蛋白酶 均為美國Sigma公司的產(chǎn)品，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2方法1.2. 1 TBS紅細胞懸浮液的制備血樣均取全血，用38 g/L的枸櫞酸鈉溶液抗凝，各抗凝血經(jīng)2 000 r/min離心10 min除去血楽，加入10倍體積的TBS溶液充分洗潘，然后離心3 min (1 000 r/min)， 去上清液，重復4次。最后以2 500 r/min離心3 min，一部分配成2% (體積分數(shù)，下同）的TBS - Ca2+紅細胞懸浮液；另一部分配成不含Ca2+的2%的TBS紅細胞懸浮液。
將紅細胞懸浮于10以[的？83中，加入2以8胰蛋白酶，在37丈下消化1.5 1。然后用？88液清 洗3次，在TBS中配成2%的紅細胞懸浮液。
1.2.2菌懸液的制備將菌種接種于黃原膠固體培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱（30C)中培養(yǎng)1~2d， 待新生菌體長出后，用 TBS-Ca2+溶液（TBS: 0. 14 m〇I/L NaCI，0.01 moi/LTris-HCI，pH=7.4; TBS-Ca2+: TBS 中含0.01 m〇I/L CaCI2，pH=7. 4)清洗菌落制成菌懸液。
黃原膠固體培養(yǎng)基的組成為：瓊脂粉2%，蛋白胨0.1%，酵母浸出粉0.1%，黃原膠0.3%，葡 萄糖0.2 %，水97. 3% (均為質(zhì)量分數(shù)）。
1.2.3血凝活力的測定活力測定在96孔U型微量血凝板中進行。每孔中先加入25 !L的TBS - Ca2+溶液，再往第1孔中加入25 !L樣品，混勻后，再從第1孔中吸取25 !L上述混合液加入到第2 孔中，以此類推作倍比稀釋，最后在每孔中加入25 !L體積分數(shù)為2%的TBS-Ca2+紅細胞懸浮液， 振蕩搖勻，在室溫下放置1~2h后，肉眼觀察。若紅細胞不發(fā)生凝集，則其在“U”型血凝板小孔 內(nèi)沉于孔底并形成一界線清晰的紅色小點；若發(fā)生凝集，紅細胞之間則形成一似網(wǎng)絡擴散的紅斑塊。 以有紅細胞凝集活力的最大稀釋度為該凝集素樣品的凝集活力（凝集效價），記為2n，以TBS-Ca2 + 作空白對照。
1.2.4糖的抑制試驗選取16種單糖、寡糖和糖蛋白，分別制成濃度為200 mm〇l/L的溶液。往每 一孔中加入25 !L糖溶液，然后加入25 !L菌懸液，再加入25 !L體積分數(shù)為2%的兔紅細胞-TBS -Ca2 +懸浮液，在室溫下靜置2 h后，檢查凝集情況。
1.2.5熱穩(wěn)定性的測定將菌懸液樣品分別在冰箱（4°C)及溫度為20、30、37、40、50、60C的恒溫水浴中處理30 min，測定各樣品的凝集活力。
1.2. 6 pH的影響試驗用HAc-NaAc緩沖液（pH為4~6)、Tris-HCl緩沖液（pH為7~9)和 Gly-NaOH 緩沖液（pH 為 10 ~ 11)將血細胞溶液的 pH 值調(diào)至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，加入菌懸液，混勻后在冰箱（4C)中放置2 h，然后將各溶液透析，使其pH值為7. 4，測定 各樣品的凝集活力。
1.2.7 Ca2 +影響的測定取菌懸液25!L，在96孔U型板中與等量的TBS-Ca2+溶液經(jīng)系列倍比稀 釋后，每孔中分別加入25 !L的10、20、40 mm〇l/L的EDTA溶液，用2%的兔紅細胞-TBS懸浮液 檢測其活性。對照組用TBS -Ca2+溶液作倍比稀釋，用2%的兔紅細胞-TBS - Ca2+懸浮液檢測其活性。
1. 2. 8鞘氨醇單胞菌XT -11的粗提蛋白對血凝活性的影響將鞘氨醇單胞菌XT -11在KS -250型 超聲波細胞粉碎機上粉碎20 min，用含0. 15 m〇l/L NaCl的TBS溶液在4C下抽提過夜。以5 000 r/min離心20 min，取上清液。加入硫酸銨并使其含量達到70%。再以5 000 r/min離心20 min，收集 沉淀物，溶于含0. 15m〇l/LNaCl的TBS溶液中，在此緩沖液中透析除去硫酸銨。測定其血凝活性。
2結(jié)果2.1菌株的鑒定菌株XT-11經(jīng)革蘭氏染色為陰性，抗酸性染色為陰性。電鏡下可見幼齡時期的菌株為桿菌，菌 體大小為（0.4~0.6) !mx (1.0~2.0 ) !m，但經(jīng)過一周以上的培養(yǎng)后，菌體呈類球狀細胞（0.5 !mx0.5!m)，不運動，不形成芽孢，有鞭毛。
該菌株只能在低于40 g/L的NaCl濃度下生長，可以利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、D-半 乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊糖、纖維二糖和D -巖藻糖等多種糖類基質(zhì)，但不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；氧化酶反應為陰性，過氧化氫酶反應為陽性，不呈現(xiàn)卵 磷脂酶和脲酶活性；不能水解淀粉、纖維素、七葉苷、酪素、明膠和油脂等，但能分解果膠；甲基紅 試驗為陽性，石蕊牛奶反應為暗紅色產(chǎn)酸；能夠由色氨酸生成吲哚并且能夠產(chǎn)生硫化氫；硝酸鹽還原 呈陰性反應。對半乳糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn)，該菌對上述各種糖均屬發(fā)酵型代 謝。該菌不能利用檸檬酸鹽，在以葡萄糖為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基上不能生長。根據(jù)菌體的形態(tài)、 運動性以及生理生化性質(zhì)，參照《伯杰細菌鑒定手冊》，初步鑒定該菌屬于鞘氨醇單胞菌屬Sphin-go漏腸 sp. [1]。
2.2菌懸液對血細胞的凝集作用用XT-11菌懸液對人的B型血及家兔、家雞、家鴿、小鼠4種動物紅細胞的凝集效價進行了試 驗，結(jié)果表明，鞘氨醇單胞菌XT-ll菌懸液對家兔的紅細胞凝集作用最強，凝集效價為26;對家雞 的凝集作用次之，為24;它不凝集小鼠和家鴿的紅細胞，也不凝集人的B型紅細胞以及經(jīng)胰蛋白酶 處理后的人的B型紅細胞。
2. 3糖抑制作用用半乳糖、肝素、甘露糖、D (-)核糖、N-乙酰半乳糖酰胺、粘蛋白、N-乙酰葡萄糖酰胺、 去唾液酸粘蛋白、巖藻糖、硫酸軟骨素、葡萄糖、！-氮苯基-a-D-吡喃（型）半乳糖、麥芽糖、 D (+)氯水合葡萄糖胺、乳糖、豬甲狀腺球蛋白共16種糖對菌懸液凝集兔紅細胞的影響試驗表明， 只有肝素可抑制菌懸液對兔血紅細胞的凝集作用，是否還有其它糖類可以抑制菌懸液對兔血紅細胞的 凝集作用，有待于進一步證明。
2. 4熱穩(wěn)定性XT-11菌懸液血凝集的熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果見圖1。由圖1可見，菌懸液在4C時的血凝集效價最 高，為26;隨著溫度的升高，其凝血活性逐漸下降；當溫度達到60°C時，菌懸液喪失血凝集活性。 這表明該菌的血凝集活性為熱敏感型。
2.5 pH對血凝活力的影響XT -11菌懸液在不同pH值的凝集反應試驗結(jié)果表明，菌懸液中的凝集素對pH的變化比較敏感 (圖2)。本試驗中，pH低于5或高于10時，兔紅細胞發(fā)生全部或部分溶血現(xiàn)象，因此，該結(jié)果沒有 統(tǒng)計。但從圖2可見，當pH為6. 0 ~10. 0時，菌懸液的凝集活性相對穩(wěn)定。
2. 6 Ca2+對血凝活力的影響在反應體系中，加入和不加入EDTA溶液，菌懸液的血凝集活性沒有任何變化，這表明XT-11 菌懸液的血凝活性不受EDTA的影響，不依賴于Ca2+的存在。
2. 7鞘氨醇單胞菌XT -11的粗提蛋白對血凝活性的影響鞘氨醇單胞菌XT-11的蛋白樣物質(zhì)經(jīng)硫酸銨鹽析、TBS溶解蛋白沉淀、透析脫鹽后，獲得的粗 提蛋白溶液，仍然具有血凝活性。
3討論近年來，對微生物凝集素的研究已成為一個新的熱點，其原因有以下幾方面：一是微生物學研究 的需要。微生物凝集素是微生物長期進化發(fā)展的結(jié)果，一些微生物通過對宿主感染來發(fā)展自己，如沙 門氏菌、鏈球菌、弧菌和擬桿菌等，它們的凝集素是感染動物宿主細胞的關(guān)鍵因素。二是微生物凝集 素在介導各種生理和病理過程中起著重要作用，在最新一代抗生素的研究中，多以微生物凝集素作為 新的藥物作用靶點。三是微生物凝集素廣泛應用于生化研究中。
一些攜有凝集素的細菌可以很容易地結(jié)合吞噬細胞，如人的多形核白細胞和鼠的腹膜巨噬細胞可 以借助于其細胞表面的菌毛等發(fā)狀附器完成此過程。菌毛（又稱纖毛、傘毛、線毛或須毛）是一種 長在細菌體表的纖細、中空、短直且數(shù)量較多的蛋白質(zhì)類附屬物，具有使菌體附著于物體表面上的功 能，直接著生于細胞質(zhì)膜上，直徑一般為3 ~10nm，每個菌體一般有250 ~300條菌毛。革蘭氏陰性 致病菌借助菌毛使自己牢固地黏附在宿主粘膜上[5]。這些蛋白質(zhì)類附屬物具有凝集紅細胞的作用。
本試驗結(jié)果表明，鞘氨醇單胞菌XT-11對紅細胞的凝集行為具有兔血紅細胞特異性。進一步用 硫酸銨鹽析法提取鞘氨醇單胞菌XT-11中的蛋白樣物質(zhì)，證實它具有血凝活性。因此，可以說，在 鞘氨醇單胞菌XT-11表面存在的這種蛋白質(zhì)對兔紅細胞表面存在的糖蛋白和糖脂具有選擇性，且同 時是一種熱敏感蛋白和pH依賴蛋白。
革蘭氏陰性菌Brucella sp.可以與人和動物紅細胞表面存在的唾液酸殘基結(jié)合，同時這種結(jié)合可 以被硫酸肝素、硫酸軟骨素、N -乙酰神經(jīng)氨酸和N -乙酰神經(jīng)酰胺-乳糖所抑制[2]。鞘氨醇單胞菌 XT-11對紅細胞的凝集活性可以被肝素所抑制，這說明它是一種具有肝素特異性的細菌凝集素。關(guān) 于肝素特異性凝集素有很多的報道。肝素和類肝素是由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸組成的一類長鏈多 糖，葡糖胺上存在3個方式各異的硫酸化位點，加之硫酸化程度不同，使得多糖鏈復雜多變。凝集素 物質(zhì)與肝素作用機理是比較復雜的，這表明鞘氨醇單胞菌XT-11與肝素的作用機理也是較復雜的， 需要提純該菌的凝集素成分，才能對其作用機理進行進一步的研究。