纖維素類物質(zhì)是地球上最豐富的天然有機(jī)物 質(zhì)[1]，廣泛存在于自然界中，占植物界總碳含量的 50%以上。一般雜草、木材和作物秸稈等都是纖維素的豐富來源，其細(xì)胞壁化學(xué)成分主要包括纖維 素、半纖維素和木質(zhì)素，其中木質(zhì)素常與半纖維素 以價(jià)鍵結(jié)合，將纖維素分子包裹在里面，形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)體系，因此對(duì)這類物質(zhì)的降解利用十分困 難[2]。目前，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶，將纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食品和化工原 料，已成為纖維素類資源再生利用研究的熱點(diǎn)[3,4]。 但迄今為止，對(duì)農(nóng)作物秸稈等含纖維素類物質(zhì)完全降解的高活性真菌株十分缺乏，單純的具有高纖維素酶活的菌株對(duì)農(nóng)作物秸稈、雜草和木屑等的分解利 用能力不一定高[5]。因此，分離和篩選高酶活和能 有效降解自然結(jié)構(gòu)的農(nóng)作物秸稈纖維素的菌種顯 得尤為重要。金顯春等[6]以纖維素、半纖維素及稻 草的降解率為指標(biāo)，篩選得到了一株對(duì)稻草秸稈有 高降解率的菌株。郝月等[7]通過測定天然纖維素酶 活，篩選出6株對(duì)天然秸稈纖維素有較強(qiáng)降解能力 的菌株。本試驗(yàn)以自然界中富含纖維素、木質(zhì)素分 解菌株的腐爛枝條、朽木為材料，以纖維素培養(yǎng)基 結(jié)合雜草、木屑進(jìn)行發(fā)酵選擇培養(yǎng)，經(jīng)過多次反復(fù) 試驗(yàn)比較，從分離所得的多個(gè)菌株中篩選出4株較 好的纖維素分解真菌，這對(duì)研究自然界纖維素類物 質(zhì)的降解利用具有重要的意義。

　　

　　1材料與方法1. 1試驗(yàn)材料濕潤的半腐朽木及大部分內(nèi)部已腐爛的獼猴 桃扦插枝條采自廣西桂林植物園。

　　

　　1.2培養(yǎng)基①初選分離培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基 (PSA):馬鈴薯200g,蔗糖20g,瓊脂15g,去離子水 1000mL,自然pH值。

　　

　?、趶?fù)選培養(yǎng)基：a.竣甲基纖維素鈉培養(yǎng)基： CMC-Na 15.0g，MS無機(jī)鹽，KH2PO4 1.0g; b.濾紙平 板培養(yǎng)基：濾紙條，MS無機(jī)鹽，KH2PO41.0g; c.纖維素 剛果紅培養(yǎng)基[8]:(NH4)2S〇4 2.0g，MgS〇4 • 7氏0 0.5g, KH2PO4 1.0g，NaCl 0.5g,CMC-Na 2.0g,剛果紅0.2g。 均添加瓊脂15g,去離子水1000 mL，pH=7.0。

　　

　?、鄹患鲋撑囵B(yǎng)基：a. MS無機(jī)鹽，葡萄糖20g, 瓊脂15g,去離子水1000mL，pH=7.0; b. MS無機(jī)鹽，蔗 糖20g,去離子水1000mL，pH=7.0,瓊脂15g; c.馬鈴 薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，去離子水1000mL，自然pH值。

　　

　?、芤后w發(fā)酵培養(yǎng)基：a.赫奇遜培養(yǎng)基(Hechisum medium)：KH2PO4 1.0g,MgSO4'7H2O 0.3g,NaCl 0.1g, CaCl2 0.1g，F(xiàn)eCl3 0.01g，NaNO3 2.5g; b. MS無機(jī)鹽添力口 濾紙；c. MS無機(jī)鹽添加CMC-Na 15.0g。均為去離子 水 1000mL，pH=7.0。

　　

　?、莨腆w發(fā)酵培養(yǎng)基：割取野外干枯的雜草，用 1%的NaOH浸泡24h后沖洗至中性，60丈干燥后剪 成2~3cm小段，去離子水濕潤裝瓶；取碎小木屑刨花 用1%的NaOH浸泡24h后沖洗至中性，60丈干燥后用 去離子水濕潤裝瓶。

　　

　　以上培養(yǎng)基均在121丈濕熱滅菌30min后使用。

　　

　　1.3試驗(yàn)方法1.3.1菌株的分離篩選將采集的內(nèi)部已腐爛的 枝條、朽木用自來水沖洗表面干凈后，帶入室內(nèi)進(jìn) 行表面滅菌。先放入75%酒精中浸泡60s后，用1.0g/L HgCl2溶液消毒4~6 min,無菌水沖洗5遍，將材料切 成小段后接入PSA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待菌株長出后 立即進(jìn)行轉(zhuǎn)接，重復(fù)多次直至得到純菌落。將所得 到的純菌株在竣甲基纖維素鈉、濾紙和剛果紅培養(yǎng) 基上進(jìn)行復(fù)篩，選出在纖維素培養(yǎng)基上生長快和水 解圈大的菌株，編號(hào)保存。

　　

　　1.3.2酶活力的測定將篩選出的菌株發(fā)酵培養(yǎng) 一定時(shí)間后，發(fā)酵液于3000r/min離心15min,上清液 作為粗酶液。羥甲基纖維素酶（CMCase )、濾紙纖維 素酶活力（FPase)的測定及計(jì)算參照王建[9]和李日 強(qiáng)等™的方法。酶活定義：以每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)1^mol 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

　　

　　1.3.3還原糖及總糖含量的測定還原糖采用 DNS法測定，總糖含量采用蒽酮-硫酸法測定™。

　　

　　1.4數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行處理。

　　

　　2結(jié)果與分析2.1菌株的篩選2. 1. 1菌株的分離經(jīng)過多代分離提純和反復(fù)試 驗(yàn)篩選比較，從自然界中的腐枝、朽木中分離得到 纖維素、木質(zhì)素分解真菌4株，分別標(biāo)記為F-1、F-2、 F-3和F-4。各菌株在以羧甲基纖維素鈉和濾紙為限 制性碳源培養(yǎng)基上的生長速率見表1。

　　

　　從表1可以看出，所分離篩選的4株真菌均能在 纖維素培養(yǎng)基上生長，但生長速率不同。當(dāng)培養(yǎng)4d 時(shí)，菌株F-4在羧甲基纖維素鈉和濾紙培養(yǎng)基上生 長無差別，直徑均為5.0cm;其它菌株則以在羧甲基 纖維素鈉培養(yǎng)基上生長較濾紙培養(yǎng)基快，其中以 F-2、F-3直徑最大，達(dá)到6.0cm, F-1直徑相對(duì)最小，但 菌絲密厚。培養(yǎng)8d時(shí)，菌株F-1、F-3、F-4在羧甲基纖■ 226 ■廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)2009年第40卷第3期維素鈉培養(yǎng)基上均已長滿整個(gè)培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿直快，也已長滿培養(yǎng)皿。觀測菌絲的稀疏程度，以菌株徑為9cm)，而在濾紙培養(yǎng)基上，F(xiàn)-2和F-4生長最F-1最密，F(xiàn)-2其次，F(xiàn)-3、F-4菌絲較長，但十分稀疏。

　　

　　表1 4株真菌在纖維素為唯一碳源培養(yǎng)基上的生長速率 Table 1 Growth rates of four fungi on medium with cellulose asthe sole carbon source培養(yǎng)時(shí)間(d) 培養(yǎng)基菌株直徑(cm) Diameter of colonyCultured time MediumF-1F-2F-3F-4羧甲基纖維素鈉平板 CMC-Na screening plate 4濾紙平板Filter paper screening plate3.6±0.126.0±0.066.0±0.115.0±0.002.0±0.004.3±0.441.0±0.005.0±0.26羧甲基纖維素鈉平板 CMC-Na screening plate8濾紙平板Filter paper screening plate9.0±0.006.4±0.209.0±0.009.0±0.005.0±0.159.0±0.005.0±0.109.0±0.00注：數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

　　

　　Note: Data are the average of three reduplications 士 standard error.

　　

　　2. 1.24株真菌產(chǎn)透明圈的大小及對(duì)濾紙的分解能力將4個(gè)菌株分別接種在纖維素剛果紅平板培 養(yǎng)基和濾紙液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，觀測各菌株透明圈 的大小和濾紙的潰爛情況。由表2可知，在纖維素剛 果紅平板培養(yǎng)基上，4個(gè)菌株均能產(chǎn)生透明圈，以 F-4透明圈直徑最大，為1.47cm;各菌株對(duì)濾紙均有 較好的分解效果，以F-2、F-3對(duì)濾紙的分解效果最 好，且F-3分解速度最快。

　　

　　表2 4株真菌產(chǎn)透明圈的大小及對(duì)濾紙的分解情況 Table 2 The effects of four fungi on clear haloes and decom¬posing filter paperF-1F-2F-3F-4透明圈•二，0.67±0.03 0.93±0.03 0.67±0.07 1.47±0.03Diameter of clear haloes濾紙分解程度Extent of decomposing ++++++++++++++filter paper注：++++濾紙成均勻糊狀；+++濾紙成有碎片糊狀；++濾紙破裂、邊緣膨脹；濾紙邊緣膨脹。

　　

　　Note： ++++filter paper was decomposed into homogeneous paste； +++ filter paper was decomposed into slurry paste； ++ filter paper was de— composed and its edge was expanded； + the edge of filter paper was expanded2. 2不同培養(yǎng)基對(duì)4株真菌富集増殖的影響將4株真菌點(diǎn)接到以MS無機(jī)鹽、分別添加蔗糖 和葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基以及PSA平板培養(yǎng)基上 進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀測平板上菌落的直徑大小及菌絲 稀疏情況。由表3可知，4個(gè)菌株在3種培養(yǎng)基上的生 長速率不同。培養(yǎng)2d時(shí)，在3種培養(yǎng)基上的啟動(dòng)生長 速度為F-4>F-3>F-1>F-2;菌株F-1在蔗糖培養(yǎng)基 上啟動(dòng)生長最快，F(xiàn)-3在PSA培養(yǎng)基上啟動(dòng)生長最 快，F(xiàn)-2、F-4在3種培養(yǎng)基上生長差別不明顯。當(dāng)培 養(yǎng)4d時(shí)，菌株F-1、F-2和F-3均以在PSA培養(yǎng)基上生 長最快，其中F-2菌落直徑較小，但菌絲厚密，F(xiàn)-4以 在蔗糖培養(yǎng)基上菌落直徑最大。當(dāng)培養(yǎng)6d時(shí)，菌株 F-1、F-3和F-4在PSA培養(yǎng)基上已長滿整個(gè)培養(yǎng)皿， 其中F-4在蔗糖培養(yǎng)基上也已長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，F(xiàn)-2 生長相對(duì)慢，未能長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，但菌絲較厚密。 綜上可知，4個(gè)菌株適合的啟動(dòng)生長培養(yǎng)基各不相 同，但均以在PSA培養(yǎng)基上增殖生長最快，因此， PSA可用于4株真菌的富集增殖。

　　

　　表3 4株真菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況 Table 3 The growth of four fungi on different media培養(yǎng)時(shí)間(d)培養(yǎng)基菌落直徑(cm) Diameter of colonyCultured timeMediumF-1F-2F-3F-4MS+Sucrose1.1±0.030.5±0.061.4±0.122.7±0.152MS+Glucose0.6±0.200.6±0.151.5±0.372.6±0.07PSA0.8±0.130.4±0.062.4±0.072.4±0.03MS+Sucrose3.7±0.202.3±0.103.8±0.155.9±0.704MS+Glucose3.5±0.122.8±0.124.2±0.444.8±0.70PSA5.4±0.504.0±0.035.7±0.644.8±1.46MS+Sucrose5.8±0.303.0±0.105.0±0.449.0±0.006MS+Glucose6.3±0.183.8±0.175.8±0.326.3±0.09PSA9.0±0.005.1±0.039.0±0.009.0±0.002. 3不同液體發(fā)酵培養(yǎng)基上各菌株的產(chǎn)酶情況 取靜置液體培養(yǎng)3d的各菌株上清液0.5mL分別 接種到不同的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)5d后， 取上清液作為粗酶液，測定其CMCase和FPase活 力。由表4可知，4個(gè)菌株在不同發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng) 后所產(chǎn)酶液的CMCase和FPase活力不同。在無碳源 的赫奇遜液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，各菌株的CMCase 活力相差不大，F(xiàn)-1和F-4的FPase活力略高于其他 菌株。在MS無機(jī)鹽分別加入濾紙和羧甲基纖維素 鈉作為碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，各菌株的酶活均有了 較大的提高，其中在濾紙培養(yǎng)基上，菌株F-1的CM- Case、FPase活力分別達(dá)到 199. 6U/L和 104.4U/L，明 顯高于其他菌株，其他菌株之間相差不大。在以羧 甲基纖維素鈉作為碳源培養(yǎng)基上，各菌株的CM- Case、FPase活力均有了明顯提高，其中以F-1的CM- Case酶活和F-4的FPase活力最高，分別為384.4U/L 和179.7U/L。由此可見，初始培養(yǎng)基中添加纖維素 碳源能促進(jìn)菌株產(chǎn)纖維素酶，且酶活高低與纖維素 種類有較大關(guān)系。

　　

　　表4 4株真菌在不同初始發(fā)酵培養(yǎng)基上的產(chǎn)酶活力Table 4 Enzymatic activity of four fungi on different fermentation media編號(hào)No.CMCase activity (U/L)FPase activity (U/L)

　　

　　abcabcF-134.5±0.05199.6±0.48384.4 ±4.5978.3±1.21104.4±0.63156.04 ±1.09F-236.1±0.12106.0±0.17189.1±0.0569.8±0.7375.3±0.58101.98±0.46F-335.1±0.05120.2±0.05308.6 ±0.2056.4±0.3573.1±0.7891.64±0.73F-434.2±0.08111.3±0.03174.5±0.1783.2±2.5575.3±0.47179.7±0.572. 4菌株在天然纖維素培養(yǎng)基上的生長及還原糖 和總糖含量將靜置液體培養(yǎng)的菌株母液分別接種到已滅 菌的雜草和木屑培養(yǎng)基上，觀測4個(gè)菌株在雜草和 木肩上繁殖生長的快慢，培養(yǎng)10d后測定培養(yǎng)基質(zhì) 中還原糖和總糖的含量（表5)。結(jié)果表明，4個(gè)菌株 對(duì)雜草和木屑的降解及對(duì)產(chǎn)物的利用各不相同。 觀察4株真菌在雜草和木屑培養(yǎng)基上的繁殖生長速 率，以F-3和F-1分別在雜草和木屑上的啟動(dòng)生長 最快，繁殖增殖速率最大。在雜草培養(yǎng)基上，還原 糖含量大小為F-2>F-3>CK>F-1>F-4,以F-2最高， 為1.09 mg/g;總糖含量大小為CK>F-1>F-2>F-4 > F-3,以對(duì)照最高，F(xiàn)-3最低。在木屑培養(yǎng)基上，4個(gè)菌 株發(fā)酵產(chǎn)物還原糖和總糖含量均明顯低于對(duì)照，其 中還原糖以F-3最低，總糖以F-1最低。菌株的生長 速度與發(fā)酵產(chǎn)物中總糖含量大小相反，生長速率越 快，總糖含量越低。由此說明，所篩選出來的菌株能 充分利用可溶性糖作為能源物質(zhì)迅速繁殖，以便有 足夠的數(shù)量來啟動(dòng)對(duì)纖維素類物質(zhì)的降解。

　　

　　表5發(fā)酵產(chǎn)物還原糖和總糖的含量及菌株的生長速率Table 5 The content of total sugar and reduced sugar in fermentation products and the growth rate of fungi編號(hào)No.還原糖含量（mg/g) Content of reduced sugar總糖含量（mg/g)

　　

　　Content of total sugar菌株生長快慢Growth rate of strains雜草Weeds木屑 Sawdust雜草 Weeds木屑 Sawdust雜草 Weeds木屑 SawdustCK0.64±0.010.70±0.022.52±0.141.65±0.14--F-10.43±0.010.37±0.012.38±0.120.46±0.01快 Fast快 FastF-21.09±0.080.31±0.012.30±0.070.69±0.13慢 Slow快 FastF-30.68±0.020.22±0.001.57±0.500.89±0.39快 Fast快 FastF-40.33±0.010.37±0.012.18±0.040.91±0.20慢 Slow快 Fast3結(jié)論與討論以自然條件下腐爛的枝條、朽木為材料，結(jié)合 纖維素發(fā)酵選擇培養(yǎng)的方法，篩選出高效穩(wěn)定的纖 維素分解菌是一條有效的途徑。腐爛的枝條、朽木 聚集著大量的天然纖維素降解菌群[12，13]，以纖維素 培養(yǎng)基結(jié)合天然雜草、木肩進(jìn)行發(fā)酵選擇培養(yǎng)，可 在保證菌株的正常生長、保持菌群穩(wěn)定的同時(shí)，篩 選得到能降解雜草和木屑的菌株。本試驗(yàn)的結(jié)果 證明該篩選方案是可行的，得到的4株真菌在具有 較高CMCase和FPase的同時(shí)，還能在單純的雜草和 木屑上快速啟動(dòng)生長并大量增殖，且生長速率與產(chǎn) 物中總糖含量成負(fù)相關(guān)。由此可初步判斷出4株真 菌分解纖維素類物質(zhì)的能力都較強(qiáng)，可作為篩選的 一個(gè)主要依據(jù)。

　　

　　由于纖維素酶是一種具有不同底物特異性的 多組分酶系M，因此基于本試驗(yàn)結(jié)果，可以考慮將4 株真菌進(jìn)行選擇性的組合培養(yǎng)，以彌補(bǔ)單菌發(fā)酵產(chǎn) 酶的缺陷[15，16]。另外，由于本試驗(yàn)是在不同時(shí)期、室 溫靜置條件下進(jìn)行的菌株培養(yǎng)試驗(yàn)，因此導(dǎo)致菌株 生長速率不均衡，若將這4株真菌進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化 試驗(yàn)，以探明其最適的生長及產(chǎn)酶條件，或?qū)ζ溥M(jìn) 行誘變、遺傳改造，勢必將更大程度提高其降解 纖維素類物質(zhì)的能力，從而更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。