纖維素作為地球上分布最廣，含量最豐富的碳水 化合物，它的降解是自然界碳素循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。纖 維素的利用和轉(zhuǎn)化對(duì)于解決目前世界能源危機(jī)，糧食 短缺、環(huán)境污染等問題具有十分重要的意義。自從纖 維素酶被人類認(rèn)識(shí)和利用以來，它在許多行業(yè)都發(fā)揮 著十分重要的作用[1]。

一直以來，研究者把分離纖維素降解菌的場(chǎng)所主 要局限于陸地土壤中，使得纖維素酶的來源受到了很 大的限制。雖然目前僅有少數(shù)學(xué)者對(duì)產(chǎn)纖維素酶的海 洋微生物進(jìn)行了研究，但已顯示出海洋微生物在開發(fā) 纖維素酶方面具有誘人的前景。本論文主要研究從海 洋微生物中分離纖維素降解菌，并對(duì)其酶活性影響因 素進(jìn)行較為深入的探索，為纖維素酶的研究提供更加 寬闊的空間[2]。

本論文擬從以下方面進(jìn)行研究：從腐爛的海洋植 物中分離出具有顯著纖維素酶活性的海洋細(xì)菌通過不菌株 產(chǎn)酶能力的影響，得出最適培養(yǎng)條件。本研究將為海 洋酶資源的開發(fā)和利用提供更多的資源基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

海洋纖維素分解菌分離用培養(yǎng)基[3]:硫酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，羧甲基纖維素鈉

15.0g，瓊脂20.0 g，半海水(海水與水按1:1的體積比 配制而成。下同）1000 mL，pH 7.5

液體種子培養(yǎng)基：硫酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，羧甲基纖維素鈉15.0 g，酵母膏3.0 g，半海水 1000 mL，pH 7.5

發(fā)酵培養(yǎng)基：硫酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g， 硫酸鎂0.5 g，羧甲基纖維素鈉15.0 g，酵母膏3.0 g， 半海水 1000 mL，pH 7.5

碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基：硫酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀

1.0g，硫酸鎂0.5 g，半海水1000 mL。

 24~56 h為菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期，56 h后為衰亡期。菌體 產(chǎn)酶能力在32 h開始明顯上升，在52 h酶活最高，以 后產(chǎn)酶能力又迅速下降。因此，取樣觀察時(shí)間以培養(yǎng) 開始后54 h為最佳。

2.3.2起始pH對(duì)菌株YX-6的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響 在實(shí)際工廠化生產(chǎn)中，pH值不易調(diào)節(jié)，因此，通 過搖瓶培養(yǎng)研究發(fā)酵初期最適pH值就顯得很重要， 最適pH值以發(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)酶量的大小為衡量指標(biāo)。 設(shè)定5.5、6.5、7.5、8.5、9.5五個(gè)不同pH值，觀察培 養(yǎng)基pH值對(duì)菌株YX-6生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力的影響。結(jié) 果顯示，較適宜菌株YX-6生長(zhǎng)的pH值為6.5~8.5, 其中pH 7.5是該菌的最適生長(zhǎng)pH (見圖3)，pH值 在6.5?8.5時(shí)，發(fā)酵液酶活力較高，當(dāng)pH值在7.5 時(shí)該菌株的產(chǎn)酶活力最高(見圖3)。此結(jié)果與中國(guó)科學(xué) 院成都生物研究所的齊云等[8]所研究的結(jié)果相吻合。

從圖4可知，菌株YX-6對(duì)于羧甲基纖維素鈉的 分解能力最強(qiáng)，對(duì)棉花也有一定的降解能力，但對(duì)于 濾紙的利用率相對(duì)較低，因此，其最適碳源為羧甲基 纖維素鈉。

2.3.4不同氮源對(duì)菌株YX-6生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響 設(shè)定硝酸鈉、硫酸銨、酵母膏、蛋白胨四種氮源， 對(duì)海洋纖維素分解菌最佳生長(zhǎng)和產(chǎn)酶氮源進(jìn)行探索， 結(jié)果如圖5所示。菌株YX-2生長(zhǎng)上的最適氮源為有 機(jī)氮源酵母膏，而產(chǎn)酶最適氮源為硫酸銨。這是由于 培養(yǎng)基的碳、氮比不同，對(duì)菌體產(chǎn)生的影響。因此， 在發(fā)酵過程中應(yīng)采取酵母膏和硫酸銨結(jié)合起來作為氮 源的方式來獲得高質(zhì)量的纖維素分解菌。

圖5不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力的影響 Fig.5 Effects of the nitrogen sources on growth and enzyme production

3結(jié)論

纖維素是地球上最豐富而可再生的生物聚合物。

經(jīng)初步統(tǒng)計(jì)，已發(fā)現(xiàn)的具有降解纖維素能力的微生物

有近200種，分布在真菌、細(xì)菌和放線菌中[9]。現(xiàn)今

分泌降解纖維素酶微生物的研究主要集中在陸生菌，

且集中在絲狀真菌的研究上，對(duì)海洋菌的研究較少 [10]。

在很多平板降解圈直接分離法分離CMCase菌 株的方法中，以剛果紅法為最好。其它的方法有的受 底物來源的限制，有的靈敏度低需培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間，有 的則因殺死菌體而需用影印移植，這就造成很多不便。 而采用剛果紅法則無(wú)上述缺點(diǎn)，剛果紅對(duì)菌體無(wú)任何 不良的影響，產(chǎn)生的透明圈清晰，非常容易辨認(rèn)，特 別是它的高靈敏度，只要菌落長(zhǎng)到用肉眼可見，就可 產(chǎn)生清晰的透明圈。剛果紅法除可用于識(shí)別產(chǎn)纖維素 酶的菌株，還可用于初步判定酶活性高低[11]。

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采用劃線分離法篩選出4株具有纖維素酶活性的 菌株，均為革蘭氏陰性細(xì)菌。其中，YX-3和菌株YX-6 為芽孢桿菌。菌株YX-6所產(chǎn)纖維素酶溫度適應(yīng)性較強(qiáng)，在20~60 °0均有較高的活性。其中，最適酶促反 應(yīng)溫度為40°C;菌株YX-6生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的最適pH值 為7.5,最佳碳源為羧甲基纖維素鈉，最佳生長(zhǎng)氮源為 酵母膏，最佳產(chǎn)酶氮源為硫酸銨。本研究將為海洋生物酶的開發(fā)和利用提供更多的 資源基礎(chǔ)。