生物體內(nèi)自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平 衡中。一旦自由基產(chǎn)生過量或者機體清除自由基的 能力減弱,就會造成自由基的代謝失衡。許多疾病 與自由基的代謝失衡導(dǎo)致的生物大分子損傷有關(guān)， 其中活性氧如超氧陰離子自由基與癌癥、糖尿病、心 腦血管疾病等密切相關(guān)⑴。因此研究和尋找外源 性自由基清除劑保持機體自由基代謝平衡具有重要 意義。目前，已發(fā)現(xiàn)多種微生物多糖具有抗氧化活 性。黃原膠在1952年首先由美國農(nóng)業(yè)部從野油菜 假單胞分離得到，因其優(yōu)良的理化性能而被廣泛關(guān) 注[2]。目前國內(nèi)外對于黃原膠的研究主要集中在 發(fā)酵提取及理化性能方面，對其生物活性的研究較 少。

黃原膠分子量大，溶解性能差，剛性雙螺旋結(jié)構(gòu) 將活性基團包圍在內(nèi)部[3]，黃原膠降解及其抗氧化性能研究，限制了其生物活性，故 需對其進行改性，其中降解是改性的重要手段之—[4]，降解后的黃原膠具有一定生物活性[5]。本文 采用氧化手段對黃原膠進行降解，考察兩種不同分 子量黃原膠寡糖的抗氧化活性，以期為黃原膠進一 步開發(fā)研究提供思路。

1實驗部分

l.i材料

黃原膠(食品級，上海聯(lián)合食品添加劑有限公 司）；魯米諾、DPPH(Sigma公司）；其余試劑（均為分 析純，上海化學(xué)試劑公司）；抗氧化測試所需溶液， 由二次蒸餾水配制。

WFZ UV2000型紫外分光光度計（上海合利儀 器有限公司）；Delta 320型pH計（梅特勒一托利多 儀分析儀器上海有限公司）；IFFM-D型流動注射化 學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁科技有限公司）；JB90-D型 強力電動攪拌機,METTLER AE200型電子分析天 平，JI80-2B型臺式離心機。

1.2黃原膠降解產(chǎn)物制備

將36 g黃原膠（XG)溶于2000 mL濃度為0. 4 mol/L的HCI溶液中，向其中加人50 mL 30% H202,于 80 t 下降解 5d，冷卻，用 0. 2 mol/L NaOH

調(diào)節(jié)溶液pH至7,先通過微孔過濾器過濾（〇. 45 jwn)，然后在蒸餾水中透析(7000,14000)6 d，冷凍 干燥后分別得到兩種黃原膠寡糖(A，B)各約1.0 g。 1.3測試表征

紅外光譜在EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜 儀上進行，采用KBr壓片法制樣，測定波數(shù)范圍為 400 ~ 4000 cm1,分辨率為 〇• 8 cm—10

采用GPC法測定黃原膠降解產(chǎn)物的相對平均 分子質(zhì)量及其分布。GPC測試條件如下：柱子: TOSOH BIOSEP G4000SWXL;流動相:0.2 M 醋酸鈉 溶液;色譜儀:Waters 515型凝膠色譜儀;檢測器: Waters 2410示差折光檢測器;進樣量:50斗;柱溫: 40弋。標準物質(zhì)為:葡聚糖，分子量分別為473000、 188000、76900、43200、10500。

1.4抗氧化性能測定

1.4.1對超氧陰離子自由基〇;•的清除

采用鄰苯三酚-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系來檢測 〇;• [6]，配制 pH = 10. 20 的 0. 5 mol/L Na2C03-NaH- C〇3緩沖溶液。并以此緩沖液作為溶劑配制1.5 x 10_3 mol/L的魯米諾溶液以及不同濃度的樣品溶液, 用1 x 1(T3 m〇l/L的鹽酸配制濃度為〇. 1 m〇l/L的鄰 苯三酚儲備液，使用前用去離子水稀釋至濃度為1 x 104 md/L。用流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀依次測 定從稀到濃的樣品溶液(緩沖液為空白溶液），讀出 峰面積，試驗重復(fù)三次。并按下式計算樣品溶液對 0;•的清除率:清除率= (A。-AJ/A。X100%。式 中:A。一空白溶液峰面積Ai—樣品溶液峰面積 1.4.2對過氧化氫的清除

配制 pH =7.20 的0• 2 mol/L Na2HP04-NaH2P0 緩沖溶液。取7支比色管，分別加人濃度為0. 1 mol/L的H202溶液（磷酸鹽緩沖液配）、不同濃度 樣品溶液各2.0 mL。充分搖勻后于33弋避光靜置 半小時，在230 mn處測量吸光度?？瞻捉M以去 離子水代替樣品溶液測定A〇，對照組以磷酸鹽緩沖 溶液代替H202溶液測定試驗重復(fù)三次，并按 下式計算樣品溶液對過氧化氫的清除率:清除率=

[1 -(Ai -A^/Ao] xl00%

式中:A。一空白組吸光度不同濃度樣品溶 液吸光度Af對照組吸光度 1.4.3還原能力的測定

還原能力測定根據(jù)文獻[7]進行并稍做改動，具 體操作為取8支比色管，分別加人pH =6. 60的0.2 mol/L磷酸緩沖液、1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL,然 后向每根管其中加人不同濃度樣品溶液2.0 mL。 充分混勻后于50 T水浴20 min,取出后立即置于冰 水中冷卻，然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混 勻后2000 r/min下離心10 min,另取8支比色管， 取離心后上層清液2.0 mL并加人去離子水2. 5 mL 和重新配制的〇. 1%的三氯化鐵溶液0• 5 mL，靜置 十分鐘，以去離子水為空白對照，于700 rnn處測定 吸光度。吸光度的增強表明還原能力的增強。

2結(jié)果與討論

2.1原料黃原膠及其寡糖的結(jié)構(gòu)表征

圖1是原料黃原膠（XG)以及黃原膠寡糖（A、 B)的紅外光譜圖。由圖可知，黃原膠降解及其抗氧化性能研究，酸性條件下氧化降解 得到的兩種分子量寡糖均保留了黃原膠的特征吸收 峰[8]，即2920 cm—1處-CH2伸縮振動吸收峰；1623 cm'1處丙酮酸酯中-C = 0伸縮振動吸收峰；1418 cm“處羧酸鹽中-C-0伸縮振動吸收峰及894 cm'1處 沒-吡喃糖環(huán)中C1-H彎曲振動吸收峰，這表明降解后 的黃原膠基本結(jié)構(gòu)單元未被破壞。XG的-0H伸縮 振動吸收峰出現(xiàn)在343601^處，而A和B的伸縮振 動吸收峰分別出現(xiàn)在3408 cm4和3417 cnf1處，表明 降解后的黃原膠寡糖形成了更多的分子內(nèi)或分子間氫 鍵，這可能是由于降解使得更多輕基暴露出來[9]。

GPC測試結(jié)果表明:兩種黃原膠寡糖A、B相對 分子質(zhì)量分別為7500和10100。

2.2抗氧化性能測定

2.2.1對超氧陰離子自由基〇2•清除

超氧陰離子自由基是所有活性氧自由基中的第 一個自由基，它具有重要的生物功能和與多種疾病 有密切關(guān)系。圖2描述了不同分子量的黃原膠寡糖 (7500-XG和10100-XG)對超氧陰離子〇2•清除效

果。它們對超氧陰離子0;•的清除活性隨著濃度的 升髙而逐漸增強，其半抑制濃度1(^ (對自由基清除 率為50%時所需要的自由基清除劑濃度)分別為〇.貶 和0.36 mmol/L。即對超氧陰離子清除能力為:10100- XG >7500-XG〇在該體系中，抗壞血釀擱氧陰離子自 由基(V的半抑制濃度IQ為0.191mmol/L。

2.2.2對過氧化氫的清除

過氧化氫按結(jié)構(gòu)劃分不屬于自由基范疇，但其 在人體內(nèi)的損傷作用和自由基類似，并能夠形成毒 性最大的輕基自由基，引發(fā)細胞膜中的不飽和脂肪 酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生危害，因此在自由基損 傷研究中過氧化氫也被算作一種自由基[1°】。圖3 描述了兩種不同相對分子質(zhì)量的黃原膠（7500-XG 和10100-XG)對過氧化氫的清除效果。它們對過氧 化氫的清除活性暉著濃度的升高而逐漸增強，其對 于過氧化氫的半抑制濃度ICM分別為〇. 19和0. 09 mmol/L。即對過氧化氫的清除能力為:l〇l〇〇-XG > 7500-XG。在該體系中，抗壞血酸對過氧化氫半抑 制濃度 IQ為 0.0030 mmol/L。

2.2.3還原能力的測定

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重 要指標。研究表明抗氧化活性和還原能力之間存在 著密切的關(guān)系[11]。圖4描述了不同分子量黃原膠 寡糖(7500-XG和10100-XG)的還原能力。由圖可 知，隨著濃度的增加，樣品的吸光值也隨之增加，還 原能力逐漸增強。在0.4 mmoI/L時，其吸光度分別 為0.06和0.27,即還原能力為：10100-XG >7500- XG。在相同體系下，抗壞血酸濃度為〇.4 mmol/L 時，吸光度為1.06。

綜上所述，兩種黃原膠寡糖對超氧陰離子自由 基〇;’黃原膠降解及其抗氧化性能研究，和過氧化氫的清除活性以及還原能力的強弱 為:10100-XG > 7500-XG。黃原膠結(jié)構(gòu)中含所有大 量輕基可能是其具有抗氧化活性的主要因素[12]。 黃原膠結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)單元的分子量是900,其中含有11 個羥基。黃原膠的降解主要由主鏈葡萄糖鏈斷裂引 起，羥基含量基本保持不變[13]。故一個7500-XG分 子平均含有92個羥基，而一個10100-XG分子平均 含有123個輕基。由此可知，10100-XG的羥基含量 較高，這可能是導(dǎo)致其對超氧陰離子自由基02•和 過氧化氫的清除活性以及還原能力較強的主要原 因，相關(guān)機理還有待進二步研究。

3結(jié)論

在酸性條件下氧化降解黃原膠，經(jīng)過透析，篩選 出兩種不同分子量的寡糖，抗氧化性能測試表明， 10100-XG >7500-XG，這可能與黃原膠寡糖肝羥基含 量有關(guān)。本研究為黃原膠寡糖進一步的改性接枝提供 依據(jù)，為黃原膠的功能做用研究《^益的參考。